באמצעות הפרוטוקול שלנו, ריבוי השכבות של דילול ביונק דמוי נוזל לא רק לקדם פיזור הומוגני של התאים encapsulated, אלא גם שומר על סביבת bioink התא מתאים. אנו משתמשים במתח הבין-גזעי כדי לעצור את המעים של התאים המוקפצים בתוך מאגר הביוינק, תוך הימנעות מעומס הלחץ הגבוה לתאים במהלך הדפסת ההבלטה. באמצעות טכנולוגיה זו, אנו יכולים ליצור מבנים רקמה תלת-מימדית עם הפצת תאים הומוגנית, מתן עובש רקמת במבחנה תפקודית לשימוש במחקרים הקרנת סמים והתחדשות הרפואה.
בעת הכנת הביוינק, חשוב לשים לב לטמפרטורה הניסיונית ולהליך טעינת ההיגרוגל, גם אם גורמים אלה יכולים להשפיע על איכות הדיו. לפני תחילת ההכנה, השתמש ביחידות סינון מזרק 0.22 מיקרומטר כדי לחסן את כל החומרים, ולהמיס ג'לטין לריכוז סופי של 10% ב- PBS של 50 מעלות צלזיוס בארון בטיחות ביולוגי. הוסיפו אנחיד מתאקרילי לתותב הג'לטין ביחס משקל של 0.6 ל-1 עם ערבוב איטי של שעה אחת לפחות ב-50 מעלות צלזיוס.
בסוף הדגירה, להעביר את הפתרון המעורב לתוך צינור סטרילי 50 מיליליטר, ולהפריד את הפתרון לשכבות על ידי צנטריפוגה. לאסוף את שכבת GelMA העליונה, ולדלל את הפתרון שנאסף עם שני כרכים של 40 עד 50 מעלות צלזיוס מים deionized. דיאליזה פתרון GelMA עם 12 כדי 14 קילודלטון מולקולרית ניתוק קרום דיאליזה נגד מים deionized במשך חמישה עד שבעה ימים ב 40 עד 50 מעלות צלזיוס, שינוי המים פעמיים ביום.
בסוף הדיאליזה, להקפיא את פתרון GelMA במינוס 80 מעלות צלזיוס לילה. הבא ליופילים את פתרון GelMA במשך שלושה עד חמישה ימים במייבש הקפאה במינוס 45 מעלות צלזיוס ו 0.2 מיליבארים של לחץ. לאחר מכן להמיס את GelMA lyophilized ב PBS בתוספת 10% סרום בקר עוברי, 25 מילימולרים HEPES, ו 0.5% photoinitiator.
כדי להשיג את bioinks GelMA פיברוין משי, לערבב את הפתרון GelMA עם כמויות שונות של פתרון פיברואין משי ראשוני כרכים שונים של PBS כפי שהוצע בטבלה. כאשר כל bioinks הוכנו, sonicate הפתרון במשך 10 עד 20 דקות. בעוד הדיו הם sonicating, לאסוף את התאים מתרבות תאים NIH/3T3 80%confluent לתוך צינור חרוט אחד 15 מיליליטר לכל פתרון bioink, ו גלולה התאים על ידי צנטריפוגה.
ואז בזהירות לשאפת את supernatants ולתלות מחדש את התאים בכל צינור עם שני מיליליטר של bioink באחת פעמים 10 לשישה תאים למיליליטר של ריכוז פתרון bioink. כדי לטעון את הביו-ינק להדפסה, הוסיפו שאספירט של 400 מיקרוליטרים של פיברואין משי עמוס תאים 0.5 GelMA לשכבה התחתונה של מזרק שני מיליליטר. מניחים את המזרק באמבט מי קרח אפס מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי להפוך את השכבה התחתונה bioink למצב ג'ל לפני טעינת 400 microliters של פיברון משי עמוס תאים 0.75 GelMA bioink מעל השכבה של פיברואין משי 0.5 GelMA.
לאחר מכן להחזיר את המזרק לאמבט הקרח במשך חמש דקות, ממשיך להוסיף כל ריכוז נוסף של bioink עמוס תאים למזרק באותו אופן. כאשר מערכת ביונק רב שכבתית עם ריכוזים שונים של פיברואין משי בתוך השכבות השונות הושגה, מחממים את הביוינק באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. בסוף הדגירה, לטעון זרבובית הדפסה 27-מד על המזרק, ולהגדיר את מהירות הזרימה ל 50 microliters לדקה, את מהירות הנעה של הזרבובית לשני מיליליטר לשנייה, ואת הגובה של הזרבובית למילימטר אחד.
לאחר מכן להדפיס את מבנה הרקמה באופן שולט באמצעות bioprinter בהתאמה אישית בטמפרטורת החדר, ולהצליב את מבנה הרקמה המודפסת ביולוגית עם 365 ננומטר של אור אולטרה סגול במשך 40 שניות ב 800 מילי וואט. ואז תרבות מבנה הרקמה המקושרת ב- DMEM בתוספת 10% סרום שור עוברי ו 1%פניצילין-סטרפטומיצין באינקובטור תרבות התא, שינוי המדיום כל שמונה שעות ביומיים הראשונים וכל יומיים עד שלושה ימים לאחר מכן. בניתוח מייצג זה, ככל שהתקדם הליך ההדפסה הביולוגית, צפיפות התאים בארות היעד פחתה בכל הקבוצות.
בקבוצת ה-GelMA אפס פיברוין משי, כ-70% מהתאים הופקדו בשכבה התחתונה. בקבוצת GelMA אחת של פיברון משי, כ-40% מהתאים הופקדו בשכבה התחתונה, וכ-5% מהתאים הופקדו בשכבה העליונה. בקבוצת GelMA רב שכבתית משי fibroin, התצהיר של תאים אנקפסולציה היה הומוגני יותר מזה של קבוצות הביקורת.
החלק הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא טעינת המולטי-שכבות של הביו-ינק SF-GelMA. פרוטוקול זה עשוי להיות מיושם על ניתוח הדפסה ביולוגית שחול אחרים המשתמשים bioinks דמוי נוזל.
