باستخدام بروتوكولنا ، فإن تعدد طبقات تخفيف الحيوية الشبيهة بالسائل لا يعزز فقط تشتتًا متجانسًا للخلايا المغلفة ولكنه يحافظ أيضًا على بيئة بيوينك مناسبة للخلايا. نستخدم التوتر بين الوجهين لوقف ترسب الخلايا المغلفة داخل خزان بيوينك، وتجنب الحمل الإجهاد القص عالية للخلايا أثناء الطباعة البثق. باستخدام هذه التكنولوجيا، يمكننا توليد 3D الأنسجة 3D مع توزيع الخلايا متجانسة، وتوفير وظيفية في نسيج في المختبر العفن لاستخدامها في فحص المخدرات والدراسات الطب التجديد.
عند إعداد bioink ، من المهم الانتباه إلى درجة الحرارة التجريبية وإجراء تحميل الهيغروجيل ، لأن هذه العوامل يمكن أن تؤثر على جودة الحبر. قبل البدء في إعداد، واستخدام وحدات 0.22 ميكرومتر حقنة تصفية لتعقيم جميع المواد، وحل الجيلاتين إلى تركيز 10٪ النهائي في برنامج تلفزيوني 50 درجة مئوية في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. إضافة anhydride الميثاكريليك إلى الحل الجيلاتين في نسبة الوزن 0.6 إلى واحد مع اثارة بطيئة لمدة ساعة واحدة على الأقل في 50 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة ، قم بنقل الحل المختلط إلى أنبوب عقيم 50 ملليلتر ، وفصل المحلول إلى طبقات عن طريق الطرد المركزي. جمع طبقة الجيلما العليا، وتمييع الحل الذي تم جمعه مع مجلدين من 40 إلى 50 درجة مئوية- المياه الأيونية. Dialyze حل GelMA مع 12 إلى 14 كيلودالتون الجزيئية قطع غشاء غسيل الكلى ضد المياه غير المتأينة لمدة خمسة إلى سبعة أيام في 40 إلى 50 درجة مئوية، وتغيير الماء مرتين يوميا.
في نهاية الغسيل الكلوي، تجميد الحل GelMA في ناقص 80 درجة مئوية بين عشية وضحاها. lyophilize المقبل حل GelMA لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام في مجفف تجميد في ناقص 45 درجة مئوية و 0.2 ملليبار من الضغط. ثم حل جيلما التحلل في برنامج تلفزيوني تكملها مع مصل البقر الجنينية 10٪ , 25 ملليمتر HEPES , و 0.5٪ photoinitiator.
للحصول على الألياف الحرير GelMA bioinks، مزيج حل جيلما مع مجلدات مختلفة من حل ليفي الحرير الأولية وأحجام مختلفة من برنامج تلفزيوني كما اقترح في الجدول. عندما تم إعداد جميع bioinks، سونيكات الحل لمدة 10 إلى 20 دقيقة. في حين أن الأحبار هي sonicating، وجمع الخلايا من 80٪ التقاء NIH/3T3 ثقافة الخلية في واحد 15 ملليلتر أنبوب مخروطي في محلول bioink، وبيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
ثم التعرق بعناية ونباتات الخلايا في كل أنبوب مع مليلترين من bioink في مرة واحدة 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر من تركيز محلول bioink. لتحميل bioink للطباعة، إضافة pirate 400 ميكرولترات من الحرير محملة الخلية الليفية 0.5 جيلما إلى الطبقة السفلية من حقنة مليلتر اثنين. ضع الحقنة في حمام ماء جليدي صفر درجة مئوية لمدة خمس دقائق لتحويل bioink الطبقة السفلية إلى حالة هلام قبل تحميل 400 ميكرولترات من الحرير الليفية المحملة بالخلايا 0.75 GelMA bioink على طبقة من الليفية الحريرية 0.5 GelMA.
ثم العودة إلى حقنة حمام الجليد لمدة خمس دقائق، والاستمرار في إضافة كل تركيز إضافي من bioink محملة بالخلايا إلى الحقنة بنفس الطريقة. عندما تم تحقيق نظام بيوينك متعدد الطبقات مع تركيزات مختلفة من الليفية الحريرية داخل الطبقات المختلفة ، إعادة تسخين الحيوية في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. في نهاية الحضانة، قم بتحميل فوهة طباعة 27 قياسا على الحقنة، وتعيين سرعة التدفق إلى 50 ميكرولترات في الدقيقة الواحدة، وسرعة نقل الفوهة إلى مليلترين في الثانية، وارتفاع الفوهة إلى ملليمتر واحد.
قم بطباعة بناء الأنسجة بعد ذلك بطريقة البثق باستخدام مطبوعة حيوية مصنوعة خصيصًا في درجة حرارة الغرفة ، وربط بنية الأنسجة المطبوعة بيولوجيًا مع 365 نانومترًا من الأشعة فوق البنفسجية لمدة 40 ثانية عند 800 مللي واط. ثم ثقافة بناء الأنسجة المترابطة في DMEM تكمل مع 10٪ مصل الأبقار الجنين و 1٪ البنسلين ستربتوميسين في حاضنة ثقافة الخلية، وتغيير المتوسطة كل ثماني ساعات خلال أول يومين وكل يومين إلى ثلاثة أيام بعد ذلك. وفي هذا التحليل التمثيلي، ومع تقدم عملية الطباعة البيولوجية، انخفضت كثافة الخلايا في الآبار المستهدفة في جميع المجموعات.
في مجموعة هلام الليفية الحريرية صفر، تم إيداع ما يقرب من 70٪ من الخلايا في الطبقة السفلية. في الليفية الحرير مجموعة جيلما واحد، تم إيداع ما يقرب من 40٪ من الخلايا في الطبقة السفلى، وتم إيداع ما يقرب من 5٪ من الخلايا في الطبقة العليا. في مجموعة GelMA الليفية المتعددة الطبقات الحريرية ، كان ترسب الخلايا المغلفة أكثر تجانسًا من مجموعات التحكم.
الجزء الأكثر أهمية من هذا البروتوكول هو تحميل متعدد الطبقات الحيوية SF-GelMA. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول على تحليل البثق الحيوي الآخر الذي يستخدم البيوينكات الشبيهة بالسائل.
