Esta investigación contó con el apoyo de la Fundación de Ciencias Naturales de Ningbo (2022J121, 2023J159), el proyecto clave de la Fundación de Ciencias Naturales de la ciudad de Ningbo (2021J256), la Fundación Abierta del Laboratorio Estatal Clave de Ingeniería Molecular de Polímeros (Universidad de Fudan) (K2024-35) y el Laboratorio Clave de Medicina de Precisión para Enfermedades Ateroscleróticas de la provincia de Zhejiang, China (2022E10026). Gracias por el apoyo técnico de las Instalaciones Principales, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Ningbo.

1. Preparación del baño de suspensión de submicrogel de κ-carragenina
<ol><li>Prepare 500 mL de baño en suspensión de κ-carragenina (0,35% en peso/vol) añadiendo 1,75 g de polvo de κ-carragenina en 500 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) dentro de un frasco de vidrio de 1.000 mL.</li>
	<li>Introduzca una barra agitadora magnética de 70 mm en la botella de vidrio para agitar la mezcla acuosa. Apriete la tapa de la botella de vidrio y luego aflójela media vuelta.</li>
	<li>Coloque la botella de vidrio en un baño de agua a 70 °C y caliéntela. Encienda el agitador magnético a una velocidad de 300 rpm, coloque la botella y revuelva hasta que el polímero se disuelva por completo.</li>
	<li>Tome otro frasco de vidrio y colóquelo en un autoclave para su esterilización, funcionando a 121 °C durante 30 minutos.</li>
	<li>Después de que el esterilizador de alta presión se enfríe a 80 °C, retire el frasco del esterilizador y transfiéralo al banco de trabajo ultralimpio para su posterior manipulación.</li>
	<li>Filtre la solución de κ-carragenina completamente disuelta en el frasco de vidrio esterilizado con un filtro de 0,22 μm. NOTA: Realice la filtración rápidamente mientras la solución está caliente para evitar que el κ-carragenina se enfríe y obstruya el filtro.</li>
	<li>Almacene la solución de κ-carragenina a 4 °C para inducir una gelificación reticulada catiónica durante 12 h.</li>
	<li>Molienda mecánica de los hidrogeles κ-carragenina con un agitador magnético de 60 mm con una velocidad de agitación de 1200 rpm a 25 °C hasta que se transforme con éxito en estado líquido, tardando aproximadamente 60 min. NOTA: Almacenar los hidrogeles de κ-carragenina entre 25-37 °C para evitar la gelificación a bajas temperaturas o la disolución a altas temperaturas.</li>
</ol>2. Preparación de biotintas compuestas de metacrilato de gelatina/fibroína de seda
<ol><li>Prepare biotintas compuestas combinando un 10% (peso/vol) de metacrilato de gelatina (GelMA) y un 6% (peso/vol) de metacrilato de fibroína de seda (SFMA) en una solución de PBS (pH 7,4). Pesar 2,0 g de GelMA y 1,2 g de polvos de SFMA por separado.</li>
	<li>Agregue lentamente los polvos en dos tubos de centrífuga de 50 ml. Agregue 10 ml de solución de PBS por separado en los tubos de centrífuga de 50 ml.</li>
	<li>Agregue un agitador magnético de 10 mm a cada uno y revuelva y caliente constantemente en un baño de agua a 45 ° C. Deje que los polvos GelMA y SFMA se disuelvan por completo, tomando aproximadamente 30 minutos.</li>
	<li>Mezclar las soluciones de GelMA y SFMA en un volumen igual bajo agitación continua a 45 °C. Filtre las biotintas compuestas con un filtro de tamaño de poro de 100 μm.</li>
	<li>Esterilizar las biotintas compuestas GelMA/SFMA mediante irradiación UV en una cabina de bioseguridad durante 12 h. NOTA: Prepare y use las biotintas inmediatamente para evitar la gelificación prematura del SFMA a través del autoensamblaje.</li>
</ol>3. Caracterización reológica del baño de suspensión de submicrogel de κ-carragenina
<ol><li>Puesta en marcha y preparación de equipos relacionados con la reología.<ol><li>Encienda el compresor de aire durante 30 minutos y asegúrese de que la presión alcance los 30 psi. Retire la abrazadera del cojinete girando la varilla de tracción en sentido contrario a las agujas del reloj. Fije la cubierta negra de abajo y gire el eje de la perilla en la parte superior del instrumento en el sentido de las agujas del reloj.</li>
		<li>Encienda el reómetro y permita que se inicialice. Encienda el interruptor de circulación de agua y deje que la temperatura alcance los 15 °C.</li>
		<li>Abra el software de control del reómetro para establecer la conexión en línea.</li>
	</ol></li>
	<li>Calibre el reómetro e instale la geometría de la placa paralela.<ol><li>Realice la calibración del instrumento en el software de control, que implica principalmente ajustar la trayectoria de inercia del instrumento de calibración. Coloque una geometría de placa paralela de 40 mm de diámetro en el extremo de la varilla de tracción. Mantenga presionado el botón de bloqueo durante 3 segundos para mover el eje del motor a la posición inicial para una colocación uniforme de la geometría.</li>
		<li>Seleccione el Administrador de calibración en el software de control y, a continuación, haga clic en Inercia, Calibración de fricción y Mapeo rotacional para calibrar la geometría de la placa paralela.</li>
	</ol></li>
	<li>Ponga a cero la altura del espacio del reómetro mediante la realización de un procedimiento estándar de puesta a cero del espacio para garantizar una medición precisa.</li>
	<li>Configure los pasos experimentales, incluida una rampa de flujo que oscila entre 0,01 y 1000 1/s de velocidad de cizallamiento, un barrido de amplitud que oscila entre el 0,1% y el 100% de deformación a 10 rad/s, un barrido de tiempo de oscilación de varios pasos que dura 60 s con deformaciones alternas de 1% y 100% a 10 rad/s, y un barrido de retención máxima de varios pasos que dura 120 s con una velocidad de corte alterna de 0,1 1/s y 10 1/s.</li>
	<li>Coloque 2 mL de suspensiones de κ-carragenina al 0,35% en la placa Peltier del reómetro. </li>
	<li>Coloque el espacio de geometría a 510 μm y elimine cualquier exceso de desbordamiento en el borde del dispositivo de sujeción. Ajuste el espacio de la muestra a 500 μm para permitir que la muestra se extienda ligeramente más allá del borde de la abrazadera.</li>
	<li>Realice un experimento de flujo seleccionando la Rampa de flujo de las opciones de diseño experimental.<ol><li>Elija la prueba de rampa de flujo en el diseño experimental. Ajuste las velocidades de cizallamiento de 0,001 a 10 1/s a una temperatura de 25 °C.</li>
		<li>Realice el paso 3.5 y el experimento de la rampa de flujo en la muestra agregada.</li>
	</ol></li>
	<li>Realice una prueba cíclica de retención máxima para evaluar el rendimiento de recuperación del material.<ol><li>Elija el barrido Peak Hold en el diseño experimental y establezca 5 experimentos consecutivos con un tiempo de 120 s a 25 °C.</li>
		<li>Ajuste la velocidad de cizallamiento a 0,01 1/s para el primer, tercer y quinto paso y a 10 1/s para el segundo y cuarto paso.</li>
		<li>Añadir una nueva muestra de 2 mL. Realice el paso 3.5 y la prueba de recuperación cíclica.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar análisis de viscoelasticidad para evaluar la posible transición gel-sol del baño de suspensión de κ-carragenina.<ol><li>Elija la prueba de barrido de amplitud en el diseño experimental. Ajuste la tensión de oscilación de 0,1% a 100% a una temperatura de 25 °C. Haga clic en Iniciar para realizar el experimento de barrido de amplitud en la muestra agregada.</li>
	</ol></li>
	<li>Realice análisis de deformación alternativos para evaluar el rendimiento de recuperación elástica del material.<ol><li>Elija el barrido de tiempo de oscilación en el diseño experimental y establezca 5 experimentos consecutivos con un tiempo de 60 s a 25 °C.</li>
		<li>Ajuste la tensión al 1% para el primer, tercer y quinto paso y al 100% para el segundo y cuarto paso.</li>
		<li>Añadir una nueva muestra de 2 mL. Realice el paso 3.5 y la prueba de recuperación cíclica continua. NOTA: Limpie la placa de geometría y la placa Peltier después de cada prueba de experimento y agregue una nueva muestra de 2 mL.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Impresión de andamios de hidrogel biomimético utilizando una bioimpresora de microextrusión diseñada a medida
<ol><li>Diseñe cubos en formato STL utilizando un software de gráficos 3D y descargue modelos similares a tejidos de la base de datos 3D (www.thingiverse.com; https://3d. nih.gov/.).<ol><li>Importe los modelos en formato STL en el software PANGO e introduzca los parámetros de impresión. Establezca las coordenadas X, Y y Z específicas del modelo en el espacio 3D, introduzca el tamaño de escala esperado del modelo en milímetros (mm), ajuste el tamaño y la relación de escala del objeto en los ejes X, Y y Z, y ajuste el ángulo de rotación del modelo en el espacio según sea necesario.</li>
		<li>Introduzca el diámetro estimado del filamento (normalmente alrededor de 200-500 μm para la mayoría de las biotintas) en el campo de espesor de capa para determinar el grosor del eje Z de cada capa. Ajuste la velocidad de impresión de acuerdo con el grosor de línea esperado (aproximadamente 10-90 mm/s) y establezca la densidad de relleno en 30%-80%.</li>
		<li>Exporte los parámetros finales como código G a una tarjeta SD.</li>
	</ol></li>
	<li>Haga funcionar la bioimpresora y la bomba de microextrusión.<ol><li>Encienda el controlador de la bomba de microextrusión, seleccione la jeringa de volumen correspondiente (5 mL) y ajuste la velocidad de extrusión a 0,08 mL/min y la duración de la extrusión en coordinación con el tiempo de impresión deseado obtenido dividiendo el volumen de hidrogel por la velocidad de extrusión.</li>
		<li>Coloque la jeringa con una aguja con un diámetro interior de 210 μm en la ranura de la jeringa de la bioimpresora.</li>
		<li>Ajuste el controlador de la jeringa para asegurarse de que el émbolo de la jeringa esté en estrecho contacto con el tornillo.</li>
		<li>Coloque 3 mL de baño de suspensión en una placa de cultivo celular de 35 mm. Coloque la antena en la plataforma en función de la configuración del código y confirme que el cabezal de impresión esté 1 mm por encima de la parte inferior de la placa. NOTA: Realice una prueba previa para garantizar la precisión de las posiciones de los platos en la plataforma de impresión durante la impresión.</li>
		<li>Inserte la tarjeta SD que contiene el código en la bioimpresora 3D, active el archivo de códigos, inicie la bioimpresora y haga clic en el botón Inicio del controlador.</li>
	</ol></li>
	<li>Procesamiento de los constructos<ol><li>Exponga la construcción impresa a una luz azul de 405 nm durante 1 minuto para iniciar la reticulación fotográfica.</li>
		<li>Retirar el gel de κ-carragenina con una pipeta de 1 mL, seguido de la adición de 3 mL de PBS (pH 7,4) para el lavado y posterior extracción. Repita este proceso para un lavado a fondo. NOTA: Realice el proceso de lavado suavemente para evitar dañar las construcciones impresas.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Bioimpresión 3D integrada de análogos de la capa muscular esofágica
<ol><li>Cultivo de células de músculo liso esofágico de conejo (eSMCs).<ol><li>Iniciar el cultivo en matraces T75 con 2 x 106 células utilizando 15 mL de medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina/estreptomicina.</li>
		<li>Mantener los eSMC a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 y 95% de aire hasta que alcancen el 80% de confluencia.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de la capa de músculo esofágico biotinta<ol><li>Aspirar el medio al alcanzar la confluencia y lavar los eSMC con 5 mL de 1x PBS.</li>
		<li>Añadir 2 mL de Tripsina-EDTA al 0,2% al matraz e incubar durante 2 min para digerir las células. Golpee el matraz para separar las celdas de la pared.</li>
		<li>Finalice la digestión agregando 2 mL de DMEM y transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 mL. Mida la densidad celular utilizando un contador de células con 10 μL de suspensión celular.</li>
		<li>Centrifugar a 675 x g durante 3 min, aspirar cuidadosamente el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en las biotintas compuestas GelMA/SFMA (tal y como se preparó en el paso 2.1). Ajuste la concentración celular final para lograr una densidad de 10 x 106 células/mL en la biotinta, optimizando así las condiciones para posteriores aplicaciones de bioimpresión 3D.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de la bioimpresora 3D y materiales asociados<ol><li>Autoclave los instrumentos de impresión esenciales, incluidas las agujas de jeringa, las pinzas, un agitador magnético y una botella de vidrio de silicato de 1000 ml, en condiciones de esterilización estándar (121 °C durante 30 min) para garantizar un entorno aséptico para el proceso de impresión.</li>
		<li>Coloque la bioimpresora dentro de un gabinete de bioseguridad y esterilícela con luz ultravioleta (UV) durante 30 minutos para mantener la esterilidad.</li>
		<li>Prepare 50 mL de κ-carragenina estéril y 5 mL de biotintas compuestas estériles GelMA/SFMA, como se describe en el paso 1 y el paso 2, respectivamente.</li>
		<li>Diseñe el modelo, establezca los parámetros deseados y prepare la bioimpresora como se describe en el paso 4.1.</li>
	</ol></li>
	<li>Inicio del proceso de bioimpresión<ol><li>Realice los procedimientos descritos en los pasos 4.2 y 4.3 para bioimprimir la capa muscular esofágica en 3D, seguidos de lavado y reemplazo de PBS.</li>
		<li>Realice la impresión celular con técnicas estériles durante todo el proceso de impresión para minimizar el riesgo de contaminación celular en la estructura impresa.</li>
	</ol></li>
	<li>Reemplazo del medio de cultivo celular posterior a la impresión<ol><li>Aspire cuidadosamente el PBS y reemplácelo con 3 mL de DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina/estreptomicina. Asegúrese de que las construcciones impresas estén completamente sumergidas para proporcionar condiciones óptimas de crecimiento celular.</li>
		<li>Incubar la placa de cultivo celular que contiene las construcciones impresas en una incubadora ajustada a 37 °C con 5% de CO2. Reemplace el medio de cultivo celular con medio fresco diariamente, usando 3 mL cada vez, y monitoree el estado de las células dentro de las construcciones usando microscopía óptica.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Evaluación de la viabilidad de las eSMCs dentro de las construcciones impresas mediante tinción de ensayos Live/Dead
<ol><li>Retire el medio de cultivo celular después de 5 h de incubación y lave las construcciones cargadas de células con PBS.</li>
	<li>Añadir 2 mL de la solución estándar de calceína-AM/yoduro de propidio (1:1000) a las construcciones cargadas de células impresas e incubar.</li>
	<li>Lave las construcciones 3 veces con PBS después de una incubación de 45 minutos y luego agregue medio de cultivo celular fresco.</li>
	<li>Observe células vivas y muertas y capture imágenes fluorescentes mediante microscopía de barrido láser confocal (CLSM).</li>
</ol>7. Observación de las eSMCs dentro de las construcciones impresas mediante tinción FITC-Phalloidin/DAPI
<ol><li>Teñir las construcciones impresas con isotiocianato de fluoresceína (FITC) marcado con faloidina (verde) para F-actina y 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, azul) para nuclear después de 5 días de incubación.</li>
	<li>Preparación de la solución de fijación<ol><li>Combine 4 mL de PBS 1x con 0,16 mL de paraformaldehído (PFA) en un tubo de polietileno (PE) de 5 mL, logrando una concentración final del 4%.</li>
		<li>Coloque la placa de cultivo que contiene las construcciones bioimpresas sobre una superficie limpia. Retire el medio y cubra suavemente las construcciones con la solución de PFA, asegurando su inmersión completa. Deje que la fijación proceda a temperatura ambiente durante 20 minutos antes de desechar la solución. NOTA: Manipule los líquidos con cuidado durante los procesos de adición y eliminación para preservar la integridad estructural de las construcciones bioimpresas.</li>
		<li>Introduzca 2,5 mL de 1x PBS en la placa de cultivo, sumergiendo completamente las construcciones para eliminar cualquier reactivo de tinción residual.</li>
	</ol></li>
	<li>Permeabilización de la membrana celular<ol><li>Formule una solución de Triton X-100 al 0,5 % añadiendo 20 μL de Triton X-100 a 4 ml de 1x PBS en un tubo de PE de 5 mL.</li>
		<li>Administre la solución Triton X-100 a las construcciones durante 30 minutos a temperatura ambiente para permear las membranas celulares, luego retire la solución.</li>
		<li>Introduzca 2,5 mL de 1x PBS en la placa de cultivo, sumergiendo completamente las construcciones para eliminar cualquier reactivo de tinción residual.</li>
	</ol></li>
	<li>Bloqueo de enlaces no específicos<ol><li>Cree una solución de bloqueo de albúmina sérica bovina (BSA) al 3% en un tubo de PE de 5 mL agregando 0,12 mL de BSA a 4 mL de PBS 1x.</li>
		<li>Introduzca la solución BSA a los constructos durante 30 minutos a temperatura ambiente para bloquear sitios no específicos, luego deseche la solución.</li>
	</ol></li>
	<li>Tinción de actina con FITC-Phalloidin<ol><li>Prepare una solución de FITC-faloidina al 0,2% en un tubo de PE de 5 mL con 4 mL de PBS 1x y 8 μL de reactivo de tinción.</li>
		<li>Sumerja los constructos en esta solución durante 60 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, luego deseche la solución.</li>
		<li>Añada 2,5 mL de PBS 1x a la placa de cultivo, sumergiendo completamente las construcciones para eliminar los reactivos de tinción residuales.</li>
	</ol></li>
	<li>Tinción nuclear con DAPI<ol><li>Aplique 4 mL de solución de tinción DAPI a los constructos, asegurando una cobertura completa.</li>
		<li>Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 minutos antes de retirar la solución de DAPI.</li>
	</ol></li>
	<li>Lavado final e inmersión en PBS: Agregue 2,5 mL de 1x PBS a la placa de cultivo, sumergiendo completamente las construcciones para eliminar los reactivos de tinción residuales. NOTA: Prepare las soluciones de tinción con anticipación y manéjelas con cuidado. En ningún momento las células deben sufrir desecación dentro del recipiente de cultivo.</li>
	<li>Observación con un microscopio confocal: Inspeccione y obtenga imágenes de las construcciones teñidas mediante microscopía confocal para evaluar el crecimiento celular, lo que garantiza una documentación completa de los resultados.</li>
</ol>8. Evaluación de la proliferación de eSMCs dentro de las construcciones impresas utilizando el ensayo CCK-8
<ol><li>Retire el medio de cultivo de los constructos en los días 7 y 14. Lave las construcciones con PBS para eliminar el medio residual y las células desprendidas.</li>
	<li>Agregue la solución CCK-8 a cada construcción siguiendo las instrucciones del fabricante. Asegúrese de que el volumen de la solución CCK-8 sea el adecuado para cubrir cada construcción por completo.</li>
	<li>Incubar los constructos con la solución CCK-8 a 37 °C durante 2 h. Después de la incubación, transfiera cuidadosamente el sobrenadante a una nueva placa de 96 pocillos.</li>
	<li>Mida la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas.</li>
</ol>

Avance de la bioimpresión 3D con medio submicrogel de κ-carragenina

<ol>
	<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+engineered+fiber+scaffolds+fabricated+by+electrospinning+for+periodontal+tissue+regeneration.">Biodegradable engineered fiber scaffolds fabricated by electrospinning for periodontal tissue regeneration.</a> J Biomater Appl. 36 (1), 55-75 (2021).</li><li>Amann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+graded,+porous+composite+of+natural+biopolymers+and+octacalcium+phosphate+guides+osteochondral+differentiation+of+stem+cells.">A graded, porous composite of natural biopolymers and octacalcium phosphate guides osteochondral differentiation of stem cells.</a> Adv Healthcare Mater. 10 (6), e2001692 (2021).</li><li>Afjoul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-gelled+alginate/gelatin+scaffolds+for+wound+healing+applications:+An+in+vitro,+in+vivo+study.">Freeze-gelled alginate/gelatin scaffolds for wound healing applications: An in vitro, in vivo study.</a> Mater Sci Eng C. 113, 110957 (2020).</li><li>Hasanzadeh, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatible+tissue-engineered+scaffold+polymers+for+3D+printing+and+its+application+for+4D+printing.">Biocompatible tissue-engineered scaffold polymers for 3D printing and its application for 4D printing.</a> Chem Eng J. 476, 146616 (2023).</li><li>Fu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage-like+protein+hydrogels+engineered+via+entanglement.">Cartilage-like protein hydrogels engineered via entanglement.</a> Nature. 618 (7966), 740-747 (2023).</li><li>Bertsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-healing+injectable+hydrogels+for+tissue+regeneration.">Self-healing injectable hydrogels for tissue regeneration.</a> Chem Rev. 123 (2), 834-873 (2023).</li><li>Hinton, T. 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M., Song, K., Chai, W., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-linkable+microgel+composite+matrix+bath+for+embedded+bioprinting+of+perfusable+tissue+constructs+and+sculpting+of+solid+objects.">Cross-linkable microgel composite matrix bath for embedded bioprinting of perfusable tissue constructs and sculpting of solid objects.</a> ACS Appl Mater Inter. 12 (7), 7855-7868 (2020).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+3D+printed+biomimetic+scaffolds+based+on+hydrogel+microparticles+for+cell+spheroid+growth.">Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth.</a> Adv Funct Mater. 30 (13), 1910573 (2020).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cation-crosslinked+&#954;-carrageenan+sub-microgel+medium+for+high-quality+embedded+bioprinting.">Cation-crosslinked &#954;-carrageenan sub-microgel medium for high-quality embedded bioprinting.</a> Biofabrication. 16, 025009 (2024).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3d+bioprinting+of+collagen+to+rebuild+components+of+the+human+heart.">3d bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart.</a> Science. 365 (6452), 482-487 (2019).</li><li>Yao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slightly+photo-crosslinked+chitosan/silk+fibroin+hydrogel+adhesives+with+hemostasis+and+anti-inflammation+for+pro-healing+cyclophosphamide-induced+hemorrhagic+cystitis.">Slightly photo-crosslinked chitosan/silk fibroin hydrogel adhesives with hemostasis and anti-inflammation for pro-healing cyclophosphamide-induced hemorrhagic cystitis.</a> Mater Today Bio. 25, 100947 (2024).</li><li>Senior, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+fluid+gels+formed+by+shear+processing+during+gelation+for+suspended+3d+bioprinting.">Agarose fluid gels formed by shear processing during gelation for suspended 3d bioprinting.</a> J Vis Exp. (195), e64458 (2023).</li><li>Roche, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=durability,+contractility+and+vascular+network+formation+in+3d+bioprinted+cardiac+endothelial+cells+using+alginate-gelatin+hydrogels.">durability, contractility and vascular network formation in 3d bioprinted cardiac endothelial cells using alginate-gelatin hydrogels.</a> Front Bioeng Biotech. 9, 63657 (2021).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+bioprinting+of+tough+hydrogel-based+vascular+conduits+for+functional+blood+vessels.">Microfluidic bioprinting of tough hydrogel-based vascular conduits for functional blood vessels.</a> Sci Adv. 8 (43), (2022).</li><li>Shao, L., Hou, R. X., Zhu, Y. B., Yao, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-shear+bioprinting+of+highly+oriented+porous+hydrogel+microfibers+to+construct+anisotropic+tissues.">Pre-shear bioprinting of highly oriented porous hydrogel microfibers to construct anisotropic tissues.</a> Biomater Sci. 9 (20), 6763-6771 (2021).</li></ol>

Los autores no tienen ningún interés financiero en los productos descritos en este manuscrito.

La preparación de baños de suspensión de submicrogel de κ-carragenina para su uso en bioimpresión es un proceso cuidadosamente orquestado que implica varios pasos críticos para garantizar que el medio resultante exhiba las propiedades deseadas para soportar las biotintas. Inicialmente, se prepara una solución de κ-carragenina disolviendo el polvo de κ-carragenina en agua desionizada a temperaturas elevadas, creando una mezcla homogénea.</...

Los andamios de ingeniería de tejidos, incluidas las fibras electrohiladas, las esponjas porosas y los hidrogeles poliméricos, desempeñan un papel fundamental en la reparación y reconstrucción de tejidos y órganos dañados al proporcionar un marco estructural que apoya el crecimiento celular, la regeneración de tejidos y la restauración de la función de los órganos 1,2,3. Sin embargo, los andamios tradicionales enfrentan desafíos para replicar con precisión las estructuras de los tejidos nativos, lo que lleva a un desajuste entre los tejidos diseñados y los naturales. Esta limitación dificulta la cicatrización eficiente de los tejidos defectuosos, lo que enfatiza la necesidad urgente de avances en el diseño de andamios para lograr una biomímesis más precisa. La bioimpresión tridimensional (3D) es una técnica de fabricación innovadora que construye con precisión estructuras complejas de tejidos biológicos capa por capa utilizando biomateriales, tintas y células4. Entre varios biomateriales, los hidrogeles poliméricos emergen como biotintas ideales con su red distintiva que facilita la encapsulación in situ de las células y apoya su crecimiento de manera crucial 5,6. Sin embargo, muchos hidrogeles blandos y altamente hidratados tienden a inducir un desenfoque o un colapso rápido de las estructuras de andamios impresas durante el proceso de impresión cuando se utilizan como biotintas. Para hacer frente a este desafío, la tecnología de bioimpresión 3D integrada emplea un baño de microgel como material de soporte, lo que permite una deposición precisa de biotinta blanda. Tras la gelificación de las biotintas de hidrogel, se obtienen andamios biónicos refinados con estructuras intrincadas mediante la eliminación del baño de microgel. Materiales como la gelatina 7,8, la agarosa9 y la goma gellan10,11 se han empleado para crear baños de microgel para la bioimpresión 3D integrada, lo que ha avanzado significativamente en la aplicación de hidrogeles blandos en la ingeniería de tejidos. Sin embargo, el tamaño de partícula a nivel de micras y no uniforme de estos geles de partículas afecta negativamente la resolución y la fidelidad de la impresión 3D 12,13,14. Existe una necesidad urgente de fabricar un flotador de suspensión similar a un gel con partículas pequeñas y uniformemente dispersas, que ofrezca ventajas para lograr una bioimpresión de alta fidelidad.
En este protocolo, se presenta un novedoso baño de suspensión de κ-carragenina granulado de sacrificio con un nivel submicrónico uniforme para la impresión 3D integrada. Este innovador comportamiento de baño de sub-microgel de transición rápida de atasco-desatasco facilita la fabricación precisa de andamios de hidrogel biomimético con alta fidelidad estructural15. Utilizando este nuevo medio de suspensión, se imprimen con éxito una serie de construcciones biomiméticas de tejidos y órganos con estructuras de tejido multicapa, empleando una biotinta compuesta por metacrilato de gelatina y fibrometacrilato de seda. En este estudio, elegimos el esófago como objeto biomimético de bioimpresión 3D principalmente porque el esófago no solo tiene una estructura de tejido de múltiples capas, sino que también su capa muscular exhibe una estructura de capas compleja circular interna y longitudinal externa. Asegurar la alineación y organización adecuadas de estas capas es esencial para la regeneración funcional de los tejidos. Por lo tanto, deseamos mucho replicar la arquitectura multicapa del esófago. Y lo que es más importante, utilizamos submicrogeles de κ-carragenina como baño de suspensión y GelMA/SFMA como biotinta para diseñar y construir un andamio biomimético para la ingeniería de tejidos. El esófago impreso se puede liberar fácilmente mediante un lavado repetido con solución salina tamponada con fosfato. Además, el baño de submicrogel de κ-carragenina está libre de sustancias citotóxicas, lo que garantiza una alta citocompatibilidad15. Las células musculares lisas cargadas dentro de andamios anisotrópicos exhiben una notable actividad de propagación. Este medio de suspensión uniforme de submicrogel ofrece una nueva vía para la fabricación de tejidos y órganos complejos a través de la bioimpresión 3D integrada.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D bioprinter</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-Diamidino-2-Phenylindole</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>C0065</td>
			<td>Ready-to-use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405 nm UV light</td>
			<td>EFL</td>
			<td>XY-WJ01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cyto smart 6749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>STELLARIS 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>VivaCell</td>
			<td>C3113-0500</td>
			<td>High Glucose, with Sodium Pyruvate and L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic rotational rheometer</td>
			<td>TA Instrument</td>
			<td>Discovery HR-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Esophageal smooth muscle cells</td>
			<td>Supplied by the Department of Cell Biology and Regenerative Medicine, Health Science Center, Ningbo University</td>
			<td></td>
			<td>Primary cells from the rabbit esophagus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>UE</td>
			<td>F9070L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate labeled phalloidin</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>CA1610</td>
			<td>300T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin methacrylate</td>
			<td>EFL</td>
			<td>EFL-GM-60</td>
			<td>60% substitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>k-carrageenan</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>C121013-100g</td>
			<td>Reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Phenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) phosphinate</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>L157759-1g</td>
			<td>365~405 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-Dead kit</td>
			<td>beyotime</td>
			<td>C2015M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Potenov</td>
			<td>PT-3502B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>P1110&#160;</td>
			<td>4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>MA0110</td>
			<td>100 &#180;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>VivaCell</td>
			<td>C3580-0500</td>
			<td>pH 7.2-7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk fibroin methacrylate</td>
			<td>EFL</td>
			<td>EFL-SilMA-001</td>
			<td>39% substitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>T8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>VivaCell</td>
			<td>C100C1</td>
			<td>0.25%, without phenol red</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embedded bioprinting of tissue-like structures using &#954;-carrageenan sub-microgel medium

La bioimpresión tridimensional (3D) incrustada que utiliza un baño de soporte de hidrogel granular se ha convertido en una técnica crítica para crear andamios biomiméticos. Sin embargo, la ingeniería de un medio de suspensión de gel adecuado que equilibre la deposición precisa de biotinta con la viabilidad y la función celular presenta múltiples desafíos, particularmente para lograr las propiedades viscoelásticas deseadas. Aquí, se fabrica un novedoso baño de soporte de gel de κ-carragenina a través de un proceso de molienda mecánica fácil de operar, que produce partículas submicroscópicas homogéneas. Estos submicrogeles exhiben un comportamiento de flujo típico de Bingham con un pequeño límite elástico y propiedades de adelgazamiento rápido por cizallamiento, que facilitan la deposición suave de las biotintas. Además, la transición reversible gel-sol y las capacidades de autocuración de la red de microgel κ-carragenina garantizan la integridad estructural de las construcciones impresas, lo que permite la creación de estructuras tisulares complejas de varias capas con características arquitectónicas definidas. Después de la impresión, los submicrogeles de κ-carragenina se pueden eliminar fácilmente con un simple lavado con solución salina tamponada con fosfato. La bioimpresión adicional con biotintas cargadas de células demuestra que las células dentro de las construcciones biomiméticas tienen una alta viabilidad del 92% y extienden rápidamente los seudópodos, además de mantener una proliferación robusta, lo que indica el potencial de esta estrategia de bioimpresión para la fabricación de tejidos y órganos. En resumen, este nuevo medio de submicrogel de κ-carragenina surge como una vía prometedora para la bioimpresión integrada de calidad excepcional, con profundas implicaciones para el desarrollo in vitro de tejidos y órganos modificados.

Tissue engineering scaffolds, including electro-spun fibers, porous sponges, and polymer hydrogels, play a pivotal role in the repair and reconstruction of damaged tissues and organs by providing a structural framework supporting cell growth, tissue regeneration, and the restoration of organ function1,2,3. However, traditional scaffolds encounter challenges in accurately replicating native tissue structures, leading to a mismatch between the engineered and natural tissues. This limitation hinders the efficient healing of defective tissues, emphasizing the urgent need for scaffold design advancements to achieve more accurate biomimicry. Three-dimensional (3D) bioprinting is an innovative manufacturing technique that precisely constructs complex biological tissue structures layer by layer using biomaterial inks and cells4. Among various biomaterials, polymer hydrogels emerge as ideal bioinks with their distinctive network that facilitates in situ encapsulation of cells and crucially supports their growth5,6. Nevertheless, many soft and highly hydrated hydrogels tend to induce blurring or rapid collapse of printed scaffold structures during the printing process when used as bioinks. To address this challenge, embedded 3D bioprinting technology employs a microgel bath as a support material, allowing precise soft bioink deposition. Upon gelation of the hydrogel bioinks, refined bionic scaffolds with intricate structures are obtained by removing the microgel bath. Materials like gelatin7,8, agarose9, and gellan gum10,11 have been employed to create microgel baths for embedded 3D bioprinting, significantly advancing the application of soft hydrogels in tissue engineering. However, the micron-level and non-uniform particle size of these particulate gels detrimentally impacts the resolution and fidelity of 3D printing12,13,14. There is an urgent need to fabricate a gel-like suspension float with small and uniformly dispersed particles, offering advantages in achieving high-fidelity bioprinting.
In this protocol, a novel sacrificial granulate &#954;-carrageenan suspension bath with a uniform sub-micron level is presented for embedded 3D printing. This innovative sub-microgel bath behavior of rapid jamming-unjamming transition facilitates the precise fabrication of biomimetic hydrogel scaffolds with high structural fidelity15. Utilizing this new suspension medium, a series of biomimetic tissue and organ constructs featuring multi-layer tissue structures are successfully printed, employing a composite bioink composed of gelatin methacrylate and silk fibro methacrylate. In this study, we chose the esophagus as the 3D bioprinting biomimetic object mainly because the esophagus not only has a multi-layered tissue structure but also its muscle layer exhibits an internal circular and external longitudinal complex layering structure. Ensuring proper alignment and organization of these layers is essential for functional tissue regeneration. Therefore, we highly desire to replicate the multilayered architecture of the esophagus. More importantly, we utilized &#954;-carrageenan sub-microgels as the suspension bath and GelMA/SFMA as the bioink to design and construct a biomimetic scaffold for tissue engineering. The printed esophagus can be easily released by repeated phosphate-buffered saline washing. Moreover, the &#954;-carrageenan sub-microgel bath is free of cytotoxic substances, ensuring high cytocompatibility15. The smooth muscle cells loaded within anisotropic scaffolds exhibit a notable spreading activity. This uniform sub-microgel suspension medium offers a new avenue for the fabrication of complex tissues and organs through embedded 3D bioprinting.

Autor destacado: Desarrollo de baños homogéneos de submicrogel de κ-carragenina para bioimpresión 3D de alta resolución

Bioimpresión integrada de estructuras similares a tejidos utilizando medio sub-microgel de κ-carragenina

3D bioprinting in a microgel-based suspension bath has provided a versatile platform for fabricating complex 3D structures using soft hydrogels, but it is still limited by the low print resolution and accuracy, hindering the practical applications of the printed products in tissue engineering. The present microgel baths often exhibit large sizes and poor dispersions, resulting in a big diameter and irregular morphology of the printed filaments. Therefore, it poses a significant challenge in preparing a microgel bath with a small particle size and uniform morphology.This protocol offers the fabrication of a homogenous and biocompatible cationic cross-linked kappa-carrageenan sub-microgel bath for high-fidelity bioprinting, through an easy-to-operate mechanical grinding strategy, Since kappa-carrageenan sub-microgels exhibit a uniform methodology with a small particle size of 565 nanometer, and a low state of 0.35%enabling precise tissue and organ construction with remarkable fidelity and high resolution.

El baño de gel de κ-carragenina granular se generó rompiendo mecánicamente los hidrogeles a granel en una suspensión de gel de partículas. El estudio más reciente demostró que las partículas de κ-carragenina exhibieron un diámetro promedio de aproximadamente 642 ± 65 nm con morfologías uniformes a 1000 rpm de mezcla mecánica15, significativamente menor que las dimensiones de los microgeles reportadas previamente en la literatura 16,17,18...

Read this Scientific Article Protocol about Embedded Bioprinting of Tissue-like Structures Using κ-Carrageenan Sub-microgel Medium at JoVE.com

Este estudio presenta un nuevo baño de suspensión de submicrogel de κ-carragenina, que muestra notables propiedades de transición reversibles de atasco-desatasco. Estos atributos contribuyen a la construcción de tejidos y órganos biomiméticos en bioimpresión 3D integrada. La impresión exitosa de tejidos similares al corazón y al esófago con alta resolución y crecimiento celular demuestra aplicaciones de bioimpresión e ingeniería de tejidos de alta calidad.

Embedded three-dimensional (3D) bioprinting utilizing a granular hydrogel supporting bath has emerged as a critical technique for creating biomimetic ...

embedded-bioprinting-tissue-like-structures-using-carrageenan-sub

Research

JoVE Journal

Engineering

Embedded Bioprinting of Tissue-like Structures Using &#954;-Carrageenan Sub-Microgel Medium

584 vistas.  Ningbo University. La bioimpresión 3D en un baño de suspensión a base de microgel ha proporcionado una plataforma versátil para la fabricación de estructuras 3D complejas utilizando hidrogeles blandos, pero aún está limitada por la baja resolución y precisión de impresión, lo que dificulta las aplicaciones prácticas de los productos impresos en la ingeniería de tejidos. Los baños de microgel actuales a menudo exhiben grandes tamaños y dispersiones deficientes, lo ...

Video: Autor destacado: Desarrollo de baños homogéneos de submicrogel de κ-carragenina para bioimpresión 3D de alta resolución

Embedded three-dimensional (3D) bioprinting utilizing a granular hydrogel supporting bath has emerged as a critical technique for creating biomimetic scaffolds. However, engineering a suitable gel suspension medium that balances precise bioink deposition with cell viability and function presents multiple challenges, particularly in achieving the desired viscoelastic properties. Here, a novel &#954;-carrageenan gel supporting bath is fabricated through an easy-to-operate mechanical grinding process, producing homogeneous sub-microscale particles. These sub-microgels exhibit typical Bingham flow behavior with small yield stress and rapid shear-thinning properties, which facilitate the smooth deposition of bioinks. Moreover, the reversible gel-sol transition and self-healing capabilities of the &#954;-carrageenan microgel network ensure the structural integrity of printed constructs, enabling the creation of complex, multi-layered tissue structures with defined architectural features. Post-printing, the &#954;-carrageenan sub-microgels can be easily removed by a simple phosphate-buffered saline wash. Further bioprinting with cell-laden bioinks demonstrates that cells within the biomimetic constructs have a high viability of 92% and quickly extend pseudopodia, as well as maintain robust proliferation, indicating the potential of this bioprinting strategy for tissue and organ fabrication. In summary, this novel &#954;-carrageenan sub-microgel medium emerges as a promising avenue for embedded bioprinting of exceptional quality, bearing profound implications for the in vitro development of engineered tissues and organs.

This study introduces a novel &#954;-carrageenan sub-microgel suspension bath, displaying remarkable reversible jamming-unjamming transition properties. These attributes contribute to the construction of biomimetic tissues and organs in embedded 3D bioprinting. The successful printing of heart/esophageal-like tissues with high resolution and cell growth demonstrates high-quality bioprinting and tissue engineering applications.

Investigación

Ingeniería

Preparation of the &#954;-Carrageenan Sub-Microgel Suspension Bath for Embedded 3D Printing

Begin by adding 1.75 grams of Kappa Carrageenan powder to 500 milliliters of PBS in a 1000 milliliter glass bottle to prepare a Kappa Carrageenan suspension bath. Then introduce a 70 millimeter magnetic stir bar into the glass bottle. Tighten the glass bottle cap and then loosen it by half a turn.Heat the glass bottle in a 70 degree Celsius water bath. Then turn on the magnetic stir at 300 RPM. Place the bottle and stir until the polymer is completely dissolved.Using a 0.22 micrometer filter, filter the completely dissolved Kappa Carrageenan solution into the sterilized glass bottle. Store the Kappa Carrageenan solution at four degrees Celsius to induce a cation cross-linked gelation for 12 hours. Then using a 60 millimeter magnetic stir, mechanically grind the Kappa Carrageenan hydrogels until they successfully transform into a liquid state.

Preparación del baño de suspensión de submicrogel κ-carragenina para impresión 3D integrada

Printing Biomimetic Hydrogel Scaffolds Using a Custom-Designed Micro-Extrusion Bioprinter

To begin, switch on the micro-extrusion pump controller. Select the corresponding volume syringe and set the extrusion rate at 0.08 milliliters per minute. Then divide the hydrogel volume by the extrusion rate and coordinate it with the desired printing time to calculate the duration of extrusion.Next, fit the syringe with a needle featuring an inner diameter of 210 micrometers into the syringe slot of the bioprinter. Adjust the syringe controller to ensure that the plunger of the syringe is in close contact with the screw. Then place three milliliters of the prepared kappa-carrageenan suspension bath into a 35 millimeter cell culture dish.Based on the code settings, position the dish on the platform and confirm that the printing head is one millimeter above the bottom of the dish. After that, insert the SD card containing the code into the 3D bioprinter. Activate the code file, start the bioprinter, and click the Start button on the controller.Then expose the printed construct to 405 nanometers of blue light for one minute to initiate photo-crosslinking. Using a one milliliter pipette, remove the kappa-carrageenan gel, followed by the addition of three milliliters of PBS for washing and subsequent removal.

Impresión de andamios de hidrogel biomiméticos mediante una bioimpresora de microextrusión diseñada a medida

Embedded 3D Bioprinting of Esophageal Muscle-Layer Analogs for Tissue Engineering

To begin, take the cultured esophageal smooth muscle cells once they attain 80%co fluency. Aspirate the medium and wash the endothelial smooth muscle cells with five milliliters of PBS. Then add two milliliters of 0.2%Trypsin-EDTA to the flask and incubate for two minutes to digest the cells.Add two milliliters of DMEM to terminate the digestion process and transfer the cell suspension to a 15 milliliter centrifuge tube. Centrifuge the tube at 675G for three minutes. Carefully aspirate the supernatant, and resuspend the cell pellet in the composite gelatin methacrylate and silk fibroin methacryloyl bioinks.After bioprinting and washing the 3D esophageal muscle layer with PBS, carefully aspirate the PBS and replace it with three milliliters of DMEM, supplemented with 10%FBS, and 1%penicillin or streptomycin.