Usando nosso protocolo, a multicamadas das diluições de bioink semelhantes a líquidos não só promove uma dispersão homogênea das células encapsuladas, mas também mantém um ambiente de bioink adequado para células. Utilizamos a tensão interfacial para impedir a sedimentação das células encapsuladas dentro do reservatório de bioink, evitando a alta carga de estresse de tesoura para as células durante a impressão de extrusão. Usando essa tecnologia, podemos gerar construções de tecido 3D com uma distribuição celular homogênea, fornecendo um molde de tecido in vitro funcional para uso em estudos de triagem de medicamentos e medicina de regeneração.
Ao preparar o bioink, é importante prestar atenção à temperatura experimental e ao procedimento de carregamento de higrâne, pois esses fatores podem afetar a qualidade da tinta. Antes de iniciar a preparação, utilize unidades de filtro de seringa de 0,22 micrômetros para esterilizar todos os materiais e dissolver a gelatina para uma concentração final de 10% em PBS de 50 graus Celsius em um armário de segurança biológica. Adicione o anidrido de metacrílico à solução de gelatina a uma relação de peso de 0,6 a um com agitação lenta por pelo menos uma hora a 50 graus Celsius.
No final da incubação, transfira a solução mista para um tubo estéril de 50 mililitros e separe a solução em camadas por centrifugação. Colete a camada superior de GelMA e dilua a solução coletada com dois volumes de água deionizada de 40 a 50 graus Celsius. Diálise a solução GelMA com uma membrana de corte de peso molecular de 12 a 14 quilodalton contra água desionizada por cinco a sete dias a 40 a 50 graus Celsius, mudando a água duas vezes por dia.
No final da diálise, congele a solução GelMA a menos 80 graus Celsius durante a noite. Em seguida, lyophilize a solução GelMA por três a cinco dias em uma secadora congelante a menos 45 graus Celsius e 0,2 milibais de pressão. Em seguida, dissolva o GelMA liofilizado em PBS complementado com soro bovino 10%, 25 milimólares HEPES e 0,5% fotoinitidor.
Para obter os bioinks gelma de fibroina de seda, misture a solução GelMA com diferentes volumes de solução inicial de fibroine de seda e diferentes volumes de PBS como sugerido na tabela. Quando todos os bioinks tiverem sido preparados, sonicar a solução por 10 a 20 minutos. Enquanto as tintas estão sonicando, colete as células de uma cultura celular NIH/3T3 80% confluente em um tubo cônico de 15 mililitros por solução de bioink, e pelota as células por centrifugação.
Em seguida, aspire cuidadosamente os supernacantes e resuspenque as células em cada tubo com dois mililitros de bioink em uma vez 10 para as seis células por mililitro de concentração de solução bioink. Para carregar o bioink para impressão, adicione 400 microliters aspirados de fibroin de seda carregado de células 0,5 GelMA à camada inferior de uma seringa de dois mililitros. Coloque a seringa em um banho de água gelada de zero graus Celsius por cinco minutos para transformar o bioink de camada inferior em um estado de gel antes de carregar 400 microliters de fibroine de seda carregada de células 0,75 GelMA bioink sobre a camada de fibroine de seda 0,5 GelMA.
Em seguida, devolva a seringa ao banho de gelo por cinco minutos, continuando a adicionar cada concentração adicional de bioink carregado de células à seringa da mesma maneira. Quando um sistema de bioink multicamadas com diferentes concentrações de fibroin de seda dentro das diferentes camadas foi alcançado, reaqueça o bioink em uma incubadora de 37 graus Celsius por 30 minutos. No final da incubação, carregue um bocal de impressão de 27 bitolas na seringa e ajuste a velocidade de fluxo para 50 microliters por minuto, a velocidade móvel do bocal para dois mililitros por segundo, e a altura do bocal para um milímetro.
Em seguida, imprima a construção do tecido de forma extrusiva usando uma bioimpressora personalizada à temperatura ambiente, e cruze a construção de tecido bioimpresso com 365 nanômetros de luz ultravioleta por 40 segundos a 800 miliwatts. Em seguida, cultura a construção de tecido transversal no DMEM complementado com soro bovino 10% fetal e 1%penicilina-estreptomicina em uma incubadora de cultura celular, mudando o meio a cada oito horas durante os dois primeiros dias e a cada dois ou três dias depois. Nesta análise representativa, à medida que o procedimento de bioimpressão progrediu, a densidade de células nos poços alvos diminuiu em todos os grupos.
No grupo de fibroina de seda zero GelMA, aproximadamente 70% das células foram depositadas na camada inferior. Na fibroina de seda um grupo De GelMA, aproximadamente 40% das células foram depositadas na camada inferior, e aproximadamente 5% das células foram depositadas na camada superior. No grupo gelma multicamada de fibroina de seda, a deposição de células encapsuladas foi mais homogênea do que a dos grupos de controle.
A parte mais crítica deste protocolo é o carregamento das multicamadas de bioink SF-GelMA. Este protocolo pode ser aplicado a outras análises de bioimpressão de extrusão que usam bioinks semelhantes a líquidos.
