Este modelo de enfermedad in vitro, se puede utilizar para estudiar la interacción de la sangre entera y las células derivadas del paciente, específicamente el endotelial, para evaluar la trombogenicidad y la eficacia de los agentes anticoagulantes. Esto es células de endotelio se puede utilizar en varias circunstancias y se puede modificar mediante la introducción de microfluídicos hechos a medida o mediante el ajuste de los parámetros de flujo sanguíneo. Además, este modelo se puede utilizar para estudiar la dinámica del trombo en condiciones inflamatorias, o para evaluar los efectos de la terapia anticoagulante y antiagregante plaqueta.
En última instancia, estos enfoques se pueden utilizar en un método de medicina personalizada. Después de obtener una muestra quirúrgica de tejido de la arteria pulmonar humana, recubre la antena para unión celular de alta afinidad a 60 mililitros con dos mililitros de cinco microgramos por mililitro de fiboronectina e incuba el plato a 37 grados centígrados durante al menos 15 minutos. Al final de la incubación, utilice fórceps estériles en un armario de flujo laminar en condiciones estériles, para transferir el tejido a un plato Petri de PBS.
Si el tejido todavía está en un anillo, corte la arteria abierta con tijeras, teniendo cuidado de no tocar la capa más interna del vaso, ya que el endotelio se daña y se retira fácilmente. Después de extraer la fibronectina, añadir cuatro mililitros de medio de célula endotelial completo al plato y utilizar fórceps para transferir la muestra de tejido en el medio, utilizar un bisturí para raspar cuidadosamente la capa interna del vaso en el medio, teniendo cuidado de evitar cualquier acumulación de lípidos que se observen en la pared del vaso. Después de que las células hayan sido cosechadas, coloque la placa en la incubadora de cultivo celular.
Si los fibroblastos contaminan el cultivo, utilice la separación de células de afinidad magnética para un CD144, de acuerdo con las instrucciones del fabricante para purificar las células. Generalmente, el cultivo se define como puro, cuando la citometría de flujo detecta un 10% o menos de células contaminantes. Cuando se ha obtenido el número suficiente de células endoteliales para uso experimental, las células endoteliales primarias se pueden caracterizar por la presencia de marcadores específicos de células endoteliales y por la ausencia de marcadores musculares lisos y de células epiteliales.
Para la preparación de la cámara de flujo, codifique un canal de un portaobjetos de seis pozos con 30 microlitros de 0,1% de gelatina e incubar este portaobjetos durante al menos 15 minutos a 37 grados centígrados. Además de las cámaras de flujo comerciales, se pueden utilizar cámaras de flujo hechas a medida con dimensiones específicas para estudiar la influencia de la geometría vascular en la dinámica de los coágulos. Mientras la diapositiva está incubando, recoger las células de un cultivo celular endotelial de la arteria pulmonar confluente con EDTA y tripina y sedimento que las células por centrifugación, volver a suspender el pellet en 600 microlitros de medio celular endotelial completo y con fuerza pero suavemente, añadir 100 microlitros de células en cada canal, añadir 50 microlitros adicionales de medio de células endoteliales completas al canal de células endotelales completas al canal de células endotelales completas al canal de células endotelales completas al canal de células endoteliales completas al canal de células endoteliales completas al canal de células endoteliales completas al canal de células endoteliales completas al canal de células endoteliales completas al canal de células endoteliales completas al canal de células endoteliales completas al canal de células endoteliales completas al canal de células endoteliales completas al canal de células endoteliales completas al canal de células endoteliales completas al canal de células endoteliales completas al canal de células endoteliales completas al canal , para proporcionar un medio suficiente para la incubación durante la noche a 37 grados centígrados y un 5% de dióxido de carbono, cambie el medio al día siguiente para lavar las células no unidas.
Después de seis días en el cultivo, las células deberían haber formado una monocapa confluente estable. En el séptimo día del cultivo de células endoteliales de la arteria pulmonar, adquiera muestras de sangre venosa de sujetos que no reciban tratamiento de anticoagulación en 109 tubos anticoagulantes de citrato monosódico y transfiera la sangre a un tubo de 50 mililitros. La sangre puede contener virus y otros agentes infecciosos.
Por lo tanto, es importante usar siempre guantes y seguir las instrucciones de seguridad para trabajar con material humano. Fluorescentemente etiquetaron las células sanguíneas con 1 a 10.000 concentración de Calcein AM Red y 50 microgramos por mililitro y añadimos Alexa 488 fibrinógeno, luego incubar la sangre a 37 grados Celsius durante 15 minutos para permitir una absorción completa. 30 minutos antes de la perfusión, tratar las células endoteliales de la arteria pulmonar con 100 microlitros de una histamina micromolar en medio de células endoteliales y 1%suero bovino fetal sin ningún otro aditivo.
Y utilice una jeringa de 20 mililitros llena de tampón de lavado para enjuagar los tubos del sistema de flujo, cargue una jeringa de tercero a 20 mililitros con dos mililitros de tampón de lavado y cargue la jeringa en una bomba de jeringa. Utilice una segunda jeringa de 20 mililitros para llenar los tubos de flujo con hippies más tampón que contenga albúmina sérica 1%bovina y utilice un conector Laura en forma de codo para conectar cuidadosamente los tubos a la micro diapositiva, conectar la salida de la diapositiva a la jeringa, reparar desde la microscopía colocando la célula que contiene la diapositiva en el escenario y ensamblar la configuración para el experimento , ajuste el microscopio y establezca los parámetros para la toma de imágenes. Recalcificación de sangre enfática.
Y este es un feliz copatrocinador de la coagulación, además tratar de evitar la formación de burbujas de aire porque esto dañará la capa celular endotelial e influirá en sus resultados. Inmediatamente antes de la perfusión, diluir la sangre dos veces con tampón de recalcificación y colocar el tubo de entrada del microobjeto en el tubo de sangre, pulse start en la bomba de la jeringa. Tan pronto como la sangre comience a fluir sobre el endotelio, presione start en el microscopio para adquirir imágenes utilizando los canales activos preseleccionados y la región de las posiciones de interés, cada 15 segundos durante cinco minutos.
Al final del análisis, detenga la grabación y la bomba de la jeringa y limpie correctamente. El etiquetado de plaquetas con Calcein AM Red y la adición de Fibrinógeno conjugado Alexa 488, permite la investigación de la formación de trombos por adhesión plaquetaria y fibra y deposición. En condiciones no estimuladas, no hay unión de plaquetas o fibrina al endotelio.
La estimulación con histamina resulta en un aumento inmediato en la adhesión plaquetaria, que alcanza una meseta después de 2,5 minutos, en este momento, las plaquetas comienzan a secretar factores autocrinos que inducen una agregación plaquetaria y escisión de fibrinógeno a fibrina, lo que resulta en fibra y deposición a los tres minutos y la formación de un agregado estable con las plaquetas después de cuatro minutos. El tratamiento con un anticoagulante directo, inhibe tanto la formación de coágulos como la adhesión plaquetaria en comparación con la sangre no tratada. El análisis inmunofluorescente de las interacciones plaquetarias de células endoteliales de la arteria pulmonar después de cinco minutos de perfusión, revela el mantenimiento de la célula endotelial, contactos celulares, como lo confirma la tinción de cadherina endotelial vascular, lo que indica que los coágulos sanguíneos se forman en las capas del modelo endotelial en lugar de en la matriz subyacente entre las brechas endoteliales.
las células endoteliales de venas umbilicales humanas demuestran menos adherencia plaquetaria y deposición de fibrina en comparación con el endotelio de la arteria pulmonar. En particular, las células endoteliales de la arteria pulmonar primaria enfermas de pacientes con hipertensión pulmonar tromboembólica crónica, presentan un aumento de la adherencia plaquetaria y más deposición de fibrina en comparación con las células sanas. La trombogenicidad del endotelio depende de múltiples factores como el origen del lecho vascular o las partes de fondo biológico.
Usando este protocolo, las disfunciones intrínsecas en los componentes vasculares y sanguíneos, así como la eficacia de la terapia anticoagulante se pueden probar durante diferentes fases de la trombosis hemostasia. Este protocolo se puede utilizar para comprender las interacciones sanguíneas y Teo, en diversas enfermedades tromboembólicas con el potencial final para predecir respuestas específicas del paciente a la terapia de anticoagulación.
