Live-Cell Bdellovibrio bacteriovorus imaging has been challenging debido al complejo ciclo de vida de estas bacterias depredadoras. Nuestro protocolo permite monitorear las etapas del ciclo de vida completo en tiempo real. Aunque nuestro protocolo se basa en una ecualización específica de cepas, puede adaptarse fácilmente a una variedad de cepas bacterianas, incluyendo cepas patógenas.
Para establecer un cultivo de B.bacteriovorus, combine un mililitro de bacterias cultivadas frescas de 24 horas con tres mililitros de cultivo de presas durante la noche en un matraz de 250 mililitros que contenga 50 mililitros de hippies de calcio suplementados con antibióticos según sea necesario. Después de una incubación de 24 horas a 30 grados Centígrados y 200 revoluciones por minuto, compruebe que las células de presa han sido completamente alicentes por microscopía de contraste facial montada en líquido. Numerosas células B.bacteriovorus fases multiataque deben estar presentes y no debe ser visible ninguna célula de E.coli o bdelloplast.
Colar el cultivo de B.bacteriovorus a través de un filtro de tamaño de poro de 0,45 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros y suspender el filtrado en una centrífuga. Luego vuelva a suspender el pellet B.bacteriovorus en tres mililitros de hippies de calcio tamponía a una densidad óptica final a 600 nanómetros de aproximadamente 0,2 e incubar las bacterias a 30 grados centígrados y 200 revoluciones por minuto durante 30 minutos. Para preparar las células huésped, seleccione una sola colonia de la cepa huésped de interés y nodular las bacterias en 10 mililitros de medio YT complementados con antibióticos según sea necesario para una incubación nocturna a 37 grados centígrados y 180 revoluciones por minuto.
A la mañana siguiente transferir dos mililitros del cultivo nocturno a un tubo de prueba de dos mililitros y peletizar las células por centrifugación. Luego vuelva a suspender el pellet en 200 microlitros de tampón de hippies de calcio. Es muy importante volver a suspender completamente todo el pellet celular después de la centrifugación para asegurarse de que la célula de presa está separada a nivel de una sola célula.
Para preparar las células para la microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo, primero, mezclar 200 miligramos de agarosa de bajo grado molecular fluorescente con 20 mililitros de hippies de calcio amortiguar y disolver la agarosa en un microondas. Vierta tres mililitros de la agaria derretida en un plato inferior de cristal de 35 milímetros y permita que la agaria se solidifique. Usando una micro espátula de laboratorio, retire cuidadosamente la almohadilla de agarosa del plato sin alterar el polo central de la almohadilla y coloque la almohadilla de lado inferior hacia arriba en una cubierta de la placa Petri.
Coloque cinco microlitros de la suspensión concentrada de la célula huésped en la almohadilla volteada y utilice un bucle de inoculación para extender las células en el polo central. A continuación, agregue cinco microlitros de la suspensión concentrada de B.bacteriovorus sobre la superficie recubierta de célula huésped sin esparcir y devuelva rápidamente el gel a la placa inferior de vidrio de 35 mililitros de lado superior hacia abajo. A continuación, cubra el plato con una tapa.
Para la microscopía de Florescencia De la lapso de tiempo del co-cultivo, coloque el plato en un porta platos Petri de manera que el plato no se mueva en el transcurso del experimento y coloque una gota de aceite de inmersión en el objetivo del microscopio invertido y una gota en la parte inferior del plato. Monte el soporte en la etapa del microscopio dentro de la cámara del microscopio invertido y en el software del microscopio establezca el aumento en 100X y la lente policromada en GFP y Mcherry. Con un iPS en Brightfield, localice el plano focal y abra el gestor sin sentido.
Mueva la etapa y utilice el botón de puntos de marca para almacenar las coordenadas de al menos 10 posiciones de interés. Cambie el val de la cámara del iPS al monitor. Establezca el plano focal y haga clic en el botón Reemplazar punto en el gestor sin sentido para calibrar cada punto.
Abra el diseñador de experimentos y la caja de apilamiento de enfermedades sin marcar. Seleccione los canales fluorescentes adecuados y los ajustes de eliminación óptimos y establezca los intervalos entre la adquisición de la imagen y el tiempo total del experimento. Habilite el mantenimiento del enfoque para las posiciones elegidas y seleccione la carpeta de datos en la que los archivos de imagen se deben guardar automáticamente.
Vuelva a comprobar todos los ajustes del control del software del microscopio e inicie el experimento de lapso de tiempo. Después de la primera hora del experimento, compruebe que todas las posiciones de la etapa todavía están enfocadas. Cuando termine el experimento de lapso de tiempo, retire la placa Petri y deseche el plato de 35 milímetros con una almohadilla de agarosa de acuerdo con los protocolos de biose seguro adecuados.
Para el procesamiento de los datos de imagen de lapso de tiempo, transfiera los datos experimentales a un ordenador cargado con el software de Fiji y abra una imagen en Fiji. En las opciones de importación de formatos biológicos, seleccione View stack con hyperstack. En el modo de color compuesto, seleccione la escala automática.
Al desplazarse por las pilas de imágenes, evaluar si las celdas y los bdelloplasts permanecieron enfocados en el transcurso del experimento. Si las manchas fluorescentes verdes del ADN y el verde mNeon están presentes dentro de las células B.bacteriovorus dentro de los bdelloplasts a lo largo de la fase de crecimiento y si se pueden visualizar todas las etapas del ciclo de vida depredador. Para analizar un bdelloplast de células B.bacteriovorus en particular, utilice una herramienta de selección para marcar la célula de interés.
A continuación, duplique la región elegida. En la imagen duplicada, haga clic en proceso y suave y para cada canal fluorescente, haga clic en imagen, color, canales herramientas y seleccione el canal de interés. A continuación, haga clic en imagen, ajuste y contraste de brillo para ajustar el brillo y el contraste de la imagen en cada canal.
Para agregar una barra de escala, seleccione analizar, herramientas y barra de escala. Para agregar una marca de tiempo a las imágenes, haga clic en imágenes, pilas y marcador de tiempo. Para guardar las imágenes modificadas, seleccione TIF.
Para guardar los datos como una secuencia de imágenes, AVI para producir una película o PNG para guardar una sola imagen del fotograma actual. Este sistema basado en microscopía de fluorescencia Time-Lapse permite el seguimiento en tiempo real de células B.bacteriovorus individuales y proporciona información valiosa sobre cada etapa del complejo ciclo de vida depredador. La fusión de mCherry pillsy permite etiquetar toda la célula depredadora en la fase de ataque, así como en la etapa temprana de la fase de crecimiento.
La transición del ataque a la fase replicativa puede ser visualizada no sólo por la formación de bdelloplast del huésped, sino también por la apariencia del replisome. El replisoma se ensambla en el polo celular invasor y se puede observar más de un replisoma dentro de un filamento B.bacteriovorus creciente a medida que avanza la fase de reproducción. Después de sintetizar varias copias del cromosoma, se termina la replicación.
Finalmente, el filamento multinucleado se somete a septación y las células progenie se liberan del bdelloplast. Las células B.bacteriovorus deben ser lo suficientemente materiales como para buscar activamente a sus presas y toda la densidad celular debe ser lo suficientemente alta como para permitir la unión celular depredadora. Esta plataforma puede ser útil en experimentos que involucran patógenos multirresistentes y para facilitar mejoras en la ingeniería genética del B.bacteriovorus como antibiótico vivo en la medicina humana y veterinaria.
