Este protocolo facilita la observación directa de varios cambios fenotípicos a nivel de una sola célula y permite el monitoreo continuo de la localización de proteínas y el tiempo de expresión génica. La principal ventaja de la microscopía de fluorescencia es que es un método sencillo para monitorear varios procesos biológicos, como la división celular y los cambios en la morfología celular en las células vivas. Asegúrese de prestar especial atención al protocolo de preparación de muestras y explorar el software del microscopio para poder localizar los ajustes y las opciones enumerados en este protocolo.
Una representación visual de este protocolo es fundamental porque permite a los usuarios ver y aprender los pasos significativos de la técnica a medida que configuran sus propios experimentos. Comience por etiquetar una alícuota de cinco a 50 microlitros del cultivo celular de interés con un tinte de tinción de membrana apropiado y agregar cinco microlitros de las células bacterianas manchadas en un resbalón de cubierta en la parte inferior de un plato de cultivo de vidrio de 35 mililitros. Coloque una losa de agarosa de 11 milímetros de diámetro sobre la muestra y toque suavemente para asegurarse de que la losa esté plana contra el resbalón de la cubierta.
A continuación, agregue aproximadamente cinco microlitros de agua alrededor del resbalón de la cubierta para evitar que la almohadilla de agarosa se seque y permita que el plato de cultivo se equilibre a la temperatura dentro de la cámara de incubación de un microscopio de desconvolución de alta resolución durante 15 a 20 minutos. Para crear una imagen de la muestra, utilice la perilla de enfoque de ajuste grueso para asegurarse de que el objetivo se reduce por completo antes de inicializar el microscopio dentro del software del microscopio. Coloque una gota de 1.517 de aceite de índice de refracción en el objetivo de inmersión en aceite de 100x y transfiera el plato de fondo de vidrio que contiene la muestra al ataúd de carcasa metálica.
Deslice suavemente la placa en la abrazadera del escenario y utilice la perilla de ajuste gruesa para elevar el objetivo hasta que el aceite entre en contacto con la parte inferior de cristal del plato. Utilice el ocular y la perilla de ajuste fino para enfocar la muestra y cambie al modo de cámara. En el software de imágenes de la ventana Resolver 3D, seleccione el icono Diseñar/Ejecutar experimento.
Aparecerá un nuevo cuadro de diálogo titulado Diseñar/Ejecutar experimento. Abra las fichas Diseño y Sección en el cuadro de diálogo para establecer el número de pilas Z y el grosor de la muestra. Para medir el grosor de las celdas de la muestra, ajuste incrementalmente el plano Z utilizando las flechas arriba y abajo del cuadro de diálogo Resolver 3D, haciendo que las celdas desenfocan como los límites superior e inferior de la Adquisición de imagen.
Después de ajustar la transmisión porcentual de la intensidad de luz y la duración de la exposición para los canales seleccionados individuales en el cuadro de diálogo Resolver 3D, haga clic en Lista de puntos para abrir la lista de puntos. En las pestañas Diseño y Lapso de tiempo, seleccione la casilla de verificación Lapso de tiempo e introduzca los parámetros de lapso de tiempo. Seleccione la opción lista Punto de visita e introduzca los puntos que se van a crear la imagen en el cuadro de texto, separando los puntos por comas o guiones para ver las secuencias completas.
A continuación, edite los nombres de archivo y las ubicaciones de los archivos en la pestaña Ejecutar y seleccione Reproducir en el cuadro de diálogo Iniciar experimento para iniciar el experimento. Al final del análisis, abra los archivos de imagen RAW de interés en un programa de desconvolución adecuado y seleccione la pestaña Proceso y Desconvolútil. Realice cualquier resta de ruido de fondo manual y ajuste de contraste de brillo en cualquiera o todos los canales de longitud de onda según sea necesario antes de guardar la imagen como un archivo TIFF.
Para la cuantificación de la longitud de celda, abra los archivos de imagen desenrevesados en el software suministrado por el fabricante o en el software de imágenes libres, como ImageJ, y abra la pestaña Herramienta. A continuación, seleccione Medir distancias y haga clic con el botón izquierdo en los puntos inicial y final del archivo de imagen deseado para medir la longitud de la celda. Para la cuantificación de la señal fluorescente, seleccione Inspector de datos.
Dibuje un cuadro con la opción Columna/Fila establecida en la dimensión específica de interés y seleccione el área con la señal que se va a cuantificar. La adición de xilosa para inducir una cepa GGS 8 da como resultado un fenotipo de seis células. Mientras que los controles vectoriales vacíos parecen similares a las células de control cultivadas en ausencia de inductor.
La sobreproducción de estafilococo aureus gpsB interrumpe la división celular en B.subtilis medida por microscopía de lapso de tiempo y cuantificación de la longitud celular. Además, los patrones de localización de FtsZ o una de las proteínas asociadas con esta proteína se pueden utilizar un reportero para estudiar y/o identificar nuevos compuestos antimicrobianos a través de la imagen de lapso de tiempo y la cuantificación de la longitud celular. Asegúrese de utilizar un aceite con el índice de refracción adecuado, ya que el índice de refracción puede cambiar dependiendo de la temperatura utilizada para la toma de imágenes.
La desconvolución se puede realizar si el usuario desea eliminar el ruido fuera de foco, y también se puede realizar un análisis de datos que implique cuantificación de señal fluorescente y mediciones de longitud y anchura de celda.
