Los métodos para la cuantificación de diversas partículas representan un aspecto crítico de la mayoría de los estudios de biología. Este protocolo permite una cuantificación precisa de los datos virales en tiempo real. Esta técnica sustituye a la medición tradicional de datos virales.
Por datos objetivos en tiempo real, estamos por debajo de nuestro intervalo de confianza, evitando los criterios de valoración intensivos en mano de obra evaluados. Este método se puede utilizar para todos los virus que inducen un efecto citopático. Demostrando el procedimiento estará Quentin Grassin, un técnico de laboratorio de nuestro laboratorio.
Para propagar y amplificar los virus H1N1, sembra de 7,5 veces 10 a 6 células MDCK en dos matraces de cultivo de tejidos de 75 centímetros cuadrados de acuerdo con los protocolos estándar, e incuba las células durante 24 horas a 37 grados Centígrados para alcanzar el 90 a 100% de confluencia. Al día siguiente, lave las células dos veces con cinco mililitros de PBS estéril por matraz por lavado, y etiquete un matraz como control. A continuación, diluya un vial descongelado de cepas del virus de la influenza A a la concentración experimental adecuada en un tubo de 1,5 mililitros que contenga un medio de propagación del virus fresco.
Use un mililitro de la cepa diluida para infectar las células MDCK a una multiplicidad de infección de 1 veces 10 a 3 negativas, o 1 veces 10 a las 4 unidades formadoras de placa negativas por célula, y agregue un mililitro de medio de propagación del virus al matraz de control. Adsorber el virus a las células durante 45 minutos a temperatura ambiente, con agitación cada 15 minutos. Al final de la incubación, retire el inóculo y reemplácelo con 15 mililitros de medio de propagación del virus complementado con un microgramo por mililitro de tripsina TPCK para facilitar la escisión de la hemaglutinina viral HA0 en las subunidades HA1 y HA2.
Luego coloque el matraz en la incubadora de 35 grados Celsius durante tres días. Al final de la incubación, compare las células en cada cultivo bajo un objetivo 40x en un microscopio de luz para evaluar los efectos citopáticos en las células. Cuando se complete el efecto citopático, agregue los sobrenadantes de cultivo celular a un tubo de 15 milímetros y recoja los desechos celulares de cada cultivo por centrifugación.
Luego, transfiera el sobrenadante de cultivo de virus clarificado a un tubo de 15 mililitros y alícute los virus de la progenie a viales criogénicos estériles de un solo uso para un almacenamiento de menos 80 grados centígrados. Para determinar la cantidad celular adecuada para la infección celular, prepare cultivos celulares MDCK confluentes de 24 horas aproximadamente al 80% como se demostró antes de lavar las células con PBS y cosecharlas con una incubación de 45 minutos en tres mililitros de 0.25% de tripsina-EDTA por matraz a 37 grados Celsius. Cuando las células se hayan desprendido, detenga la reacción con siete mililitros de medio de cultivo fresco por matraz y cuente las células de cada cultivo.
Diluir las células a 4 veces 10 a las 5ª células por mililitro de medio de cultivo celular y realizar diluciones en serie dobles de las células según lo indicado. Coloque una placa E a temperatura ambiente durante varios minutos antes de agregar 100 microlitros de medio de cultivo celular a cada pozo sin tocar los electrodos de la placa E. Desbloquee las bases e inserte el extremo frontal de la placa en el bolsillo de la cuna del instrumento de medición de impedancia.
Cierre la puerta de la incubadora y abra el software. En la configuración predeterminada del patrón de experimento, resalte las bases seleccionadas y haga doble clic en la página superior para introducir el nombre del experimento. Haga clic en Diseño e introduzca la información de muestra necesaria para cada pozo seleccionado de la placa.
Haga clic en Programar, Pasos y Agregar un paso. El software agregará automáticamente un paso de un segundo para medir la impedancia de fondo Haga clic en Ejecutar e Iniciar, Continuar. Haga clic en Trazar y agregar para seleccionar los pozos apropiados, confirmando que la impedancia de fondo está entre 0.1 y 0.1 negativo antes de continuar con el siguiente paso.
A continuación, retire la placa de la base y agregue 100 microlitros de cada suspensión celular a los pozos apropiados por duplicado. Deje la placa E en la campana de flujo laminar durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir una distribución uniforme de las celdas en el fondo de los pozos antes de cargar la placa E en el bolsillo de la cuna. Haga clic en Programar y agregar paso e introduzca valores para supervisar las celdas cada 30 minutos durante 200 repeticiones antes de seleccionar Inicio, Continuar.
Para comprobar y trazar los datos de impedancia celular, haga clic en Trazar y seleccione la concentración de células que está justo antes de la fase estacionaria 24 horas después de la siembra para obtener células que todavía están en una fase de crecimiento durante la infección viral. Para determinar la correlación entre los valores de CIT50 y la multiplicidad de la infección, después de cultivar 3 veces 10 a la 4ª célula MDCK recién dividida en cada pocillo de la placa electrónica de microtitulación durante 24 horas, lave las células dos veces con 100 microlitros de medio de propagación de virus fresco por pozo, por lavado, y use una pipeta de un solo canal para agregar 100 microlitros de suspensión viral a cada pozo. Cuando se hayan agregado todas las diluciones del virus, cargue suavemente la placa en el bolsillo de la cuna del instrumento a 35 grados Celsius y comience a monitorear la impedancia celular cada 15 minutos durante al menos 100 horas, como se ha demostrado.
Después de dos ciclos de mediciones, haga clic para pausar el aparato y retire la placa E de la base. Agregue 100 microlitros de medio de propagación del virus suplementado con tripsina TPCK a cada pozo y devuelva la placa E al bolsillo de la cuna. Luego, comience el análisis.
Para evaluar la cinética de supervivencia del virus de la influenza A, agregue cloruro de sodio a una concentración final de 35 gramos por litro en agua destilada y agregue 900 microlitros de la solución salina resultante a criotubos de dos mililitros. Agregue 100 microlitros virales a cada criotubo y coloque los tubos en la incubadora de 35 grados Celsius durante el período de tiempo experimental apropiado. El día antes del final de la incubación, sembrar 3 veces 10 a la 4ª célula MDCK recién dividida y 100 microlitros de medio de propagación del virus por pozo en una placa de microtitulación de 16 pocillos en pasos repetidos, lo que permite la medición de la impedancia de fondo y la distribución uniforme de las células en el fondo de los pozos.
Luego cultive las células durante 24 horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, lave las células dos veces, luego infecte las células con 100 microlitros del virus destilado con solución salina diluido 10 veces en un medio de cultivo fresco, como se ha demostrado, y controle la impedancia celular cada 15 minutos durante al menos 100 horas. Aquí, se muestran los datos en bruto obtenidos después de 120 horas con diferentes concentraciones de células MDCK.
Después de 24 horas, las mediciones del índice celular revelaron que las células en pozos sembrados con 3 veces 10 a las 4tas células todavía estaban en la fase exponencial de crecimiento, por lo tanto, esta concentración celular se utilizó para experimentos posteriores. Los cultivos de células MDCK demuestran una clara relación lineal entre el CIT50 y la multiplicidad inicial de infección por el virus de la gripe. Los resultados de un experimento cinético de supervivencia típico muestran una disminución en el índice celular debido al efecto citopático inducido por el virus.
El CIT50 se puede utilizar para calcular la pendiente de inactivación viral para cada virus en cada condición para la determinación de qué virus tuvo la mayor estabilidad en el entorno estudiado. La estabilidad del virus se correlaciona indirectamente con la pendiente de inactivación, lo que permite, por ejemplo, identificar residuos de aminoácidos en la glicoproteína de hemaglutinina que están involucrados en la supervivencia del virus de la influenza A fuera del huésped. Esta técnica es muy sensible a pequeñas variaciones.
Por lo tanto, se recomienda el uso de un contador celular automático para obtener resultados reproducibles entre experimentos. Este método también se puede utilizar para comparar la replicación de diferentes virus, para investigar el tropismo del virus para varias líneas celulares a la vez, o para estudiar pasos específicos del ciclo del virus.
