Métodos para quantificação de partículas variadas representam um aspecto crítico da maioria dos estudos de biologia. Este protocolo permite uma quantificação precisa dos dados virais em tempo real. Esta técnica substitui a medição tradicional de dados virais.
Por dados objetivos em tempo real, estamos abaixo do nosso intervalo de confiança, evitando pontos finais intensivos em mão-de-obra avaliados. Este método pode ser usado para todos os vírus que induzem um efeito citopático. Demonstrando o procedimento estará Quentin Grassin, um técnico de laboratório do nosso laboratório.
Para propagar e amplificar os vírus H1N1, as sementes 7,5 vezes 10 a 6 células MDCK em dois frascos de cultura tecidual de 75 centímetros quadrados de acordo com os protocolos padrão, e incubar as células por 24 horas a 37 graus Celsius para atingir 90 a 100% de confluência. No dia seguinte, lave as células duas vezes com cinco mililitros de PBS estéreis por frasco por lavagem, e rotule um frasco como controle. Em seguida, dilui um frasco descongelado de estoque de vírus influenza A para a concentração experimental apropriada em um tubo de 1,5 mililitro contendo um meio de propagação de vírus fresco.
Use um mililitro do estoque diluído para infectar as células MDCK em uma multiplicidade de infecção de 1 vezes 10 para o 3 negativo, ou 1 vezes 10 para as 4 unidades negativas de formação de placas por célula, e adicionar um mililitro de meio de propagação do vírus ao frasco de controle. Adsornar o vírus para as células por 45 minutos em temperatura ambiente, com agitação a cada 15 minutos. No final da incubação, remova o inóculo e substitua-o por 15 mililitros de meio de propagação de vírus suplementados com um micrograma por mililitro de trippsina TPCK para facilitar o decote da hemaglutina viral HA0 em subunidades HA1 e HA2.
Em seguida, coloque o frasco na incubadora de 35 graus Celsius por três dias. No final da incubação, compare as células em cada cultura sob um objetivo de 40x em um microscópio leve para avaliar os efeitos citopáticos nas células. Quando o efeito citopático estiver completo, adicione os supernaentes da cultura celular a um tubo de 15 milímetros e colete os detritos celulares de cada cultura por centrifugação.
Em seguida, transfira a cultura do vírus clarificado para um tubo de 15 mililitros, e aliquotar os vírus progêneros para frascos criogênicos estéreis de uso único para menos 80 graus Celsius de armazenamento. Para determinar a quantidade celular apropriada para infecção celular, prepare 24 horas aproximadamente 80% de culturas celulares MDCK confluentes como demonstrado antes de lavar as células com PBS e colhê-las com uma incubação de 45 minutos em três mililitros de 0,25% Trypsin-EDTA por frasco a 37 graus Celsius. Quando as células se separarem, pare a reação com sete mililitros de cultura fresca por frasco, e conte as células de cada cultura.
Diluir as células para 4 vezes 10 a 5ª células por mililitro de cultura celular média e realizar diluições serial duplas das células como indicado. Coloque uma placa E em temperatura ambiente por vários minutos antes de adicionar 100 microliters de cultura celular média a cada poço sem tocar nos eletrodos da placa E. Desbloqueie os berços e insira a parte dianteira da placa no bolso do berço do instrumento de medição de impedância.
Feche a porta da incubadora e abra o software. Na configuração padrão do padrão do padrão de testes, destaque os berços selecionados e clique duas vezes na página superior para inserir o nome do experimento. Clique em Layout e insira as informações necessárias para cada poço selecionado da placa.
Clique em Agendar, Passos e Adicionar um passo. O software adicionará automaticamente um passo de um segundo para medir a impedância de fundo Clique em Executar e Iniciar, Continuar. Clique em Plot e Add para selecionar os poços apropriados, confirmando que a impedância de fundo está entre 0.1 e 0.1 negativo antes de prosseguir para a próxima etapa.
Em seguida, retire a placa do berço e adicione 100 microliters de cada suspensão celular aos poços apropriados em duplicata. Deixe a placa E na coifa de fluxo laminar por 30 minutos à temperatura ambiente para permitir a distribuição uniforme das células na parte inferior dos poços antes de carregar a placa E no bolso do berço. Clique em Agendar e Adicionar Passo e digite valores para monitorar as células a cada 30 minutos para 200 repetições antes de selecionar Iniciar, Continuar.
Para verificar e traçar os dados de impedância celular, clique em Plot e selecione a concentração de células que está pouco antes da fase estacionária 24 horas após a semeadura para obter células que ainda estão em fase de crescimento durante a infecção viral. Para determinar a correlação entre os valores cit50 e a multiplicidade de infecção, depois de culminar 3 vezes 10 para a 4ª células MDCK recém-divididas em cada poço da placa de microtização eletrônica por 24 horas, lave as células duas vezes com 100 microliters de meio de propagação de vírus fresco por poço, por lavagem, e use uma pipeta de canal único para adicionar 100 microliters de suspensão viral a cada poço. Quando todas as diluições do vírus tiverem sido adicionadas, carregue suavemente a placa no bolso do berço do instrumento a 35 graus Celsius, e comece a monitorar a impedância celular a cada 15 minutos por pelo menos 100 horas, como demonstrado.
Após dois ciclos de medições, clique para pausar o aparelho e remova a placa E do berço. Adicione 100 microliters de meio de propagação de vírus complementados com trippsina TPCK em cada poço e devolva a placa E no bolso do berço. Então, comece a análise.
Para avaliar a cinética de sobrevivência do vírus influenza A, adicione cloreto de sódio a uma concentração final de 35 gramas por litro em água destilada e adicione 900 microliters da solução salina resultante aos tubos crio-tubos de dois mililitros. Adicione 100 microliters de estoque viral a cada tubo criogênico e coloque os tubos na incubadora de 35 graus Celsius para o período experimental adequado. Um dia antes do fim da incubação, a semente 3 vezes 10 para a 4ª células MDCK recém-divididas e 100 microliters de meio de propagação de vírus por poço em uma placa de microtiter de 16 poços em etapas repetidas, permitindo a medição da impedância de fundo e distribuição uniforme das células na parte inferior dos poços.
Em seguida, cresça as células por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono. No dia seguinte, lave as células duas vezes, depois infecte as células com 100 microlitres do vírus salino diluído 10 vezes em meio de cultura fresca, como demonstrado, e monitore a impedância celular a cada 15 minutos por pelo menos 100 horas. Aqui, são mostrados dados brutos obtidos após 120 horas com diferentes concentrações de células MDCK.
Após 24 horas, as medições do índice celular revelaram que as células em poços semeados com 3 vezes 10 a 4ª células ainda estavam na fase exponencial de crescimento, portanto, essa concentração celular foi utilizada para experimentos subsequentes. As culturas celulares MDCK demonstram uma clara relação linear entre o CIT50 e a multiplicidade inicial de infecção pelo vírus da gripe. Os resultados de um experimento cinético típico de sobrevivência mostram uma diminuição no índice celular devido ao efeito citopático induzido pelo vírus.
O CIT50 pode ser usado para calcular a inclinação de inativação viral para cada vírus em cada condição para a determinação de qual vírus teve maior estabilidade no ambiente estudado. A estabilidade do vírus se correlaciona indiretamente com a inclinação de inativação, permitindo, por exemplo, resíduos de aminoácidos na glicoproteína hemaglutina que estão envolvidos na sobrevivência do vírus influenza A fora do hospedeiro para ser identificado. Esta técnica é muito sensível a pequenas variações.
Portanto, o uso de um contador automático de células é incentivado a obter resultados reprodutíveis entre experimentos. Este método também pode ser usado para comparar a replicação de diferentes vírus, para investigar o tropismo do vírus para várias linhas celulares de cada vez, ou para estudar etapas específicas do ciclo do vírus.
