Çeşitli parçacık nicelleştirme yöntemleri, çoğu biyoloji çalışmalarının kritik bir yönünü temsil eder. Bu protokol, viral verilerin gerçek zamanlı olarak kesin bir şekilde ölçülmesini sağlar. Bu teknik, viral verilerin geleneksel ölçümünün yerini alır.
Objektif gerçek zamanlı verilerle, güven aralığımızın altındayız ve emek yoğun uç noktaların değerlendirilmesini önlüyoruz. Bu yöntem, sitopatik etkiye neden olan tüm virüsler için kullanılabilir. Prosedürü gösteren Quentin Grassin, laboratuvarımızdan bir laboratuvar teknisyeni.
H1N1 virüslerini yaymak ve yükseltmek için, standart protokollere göre iki adet 75 santimetrekarelik doku kültürü şişesi üzerindeki 6 MDCK hücresine 7,5 çarpı 10 tohum ve hücreleri 24 saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırarak %90 ila %100 birışıklığa ulaşın. Ertesi gün, hücreleri yıkama başına şişe başına beş mililitre steril PBS ile iki kez yıkayın ve kontrol olarak bir şişe etiketleyin. Daha sonra, çözülmüş bir influenza şişesini seyreltin A virüs stoğu, taze virüs yayılma ortamı içeren 1,5 mililitrelik bir tüpte uygun deneysel konsantrasyona.
MDCK hücrelerini negatif 3'e 1 kez 10 veya hücre başına negatif 4 plak oluşturan üniteye 1 kez 10 enfeksiyon çokluğunda enfekte etmek için seyreltilmiş stokun bir mililitresini kullanın ve kontrol şişesine bir mililitre virüs yayılma ortamı ekleyin. Virüsü oda sıcaklığında 45 dakika boyunca hücrelere adsorbe edin, her 15 dakikada bir karıştırın. Kuluçkanın sonunda, inoculumu çıkarın ve viral hemagglutinin HA0'ın HA1 ve HA2 alt birimlerine bölünmesini kolaylaştırmak için TPCK tripsin mililitresi başına bir mikrogram ile desteklenmiş 15 mililitre virüs yayılma ortamı ile değiştirin.
Daha sonra şişeyi üç gün boyunca 35 santigrat derecelik inkübatöre yerleştirin. Kuluçkanın sonunda, hücreler üzerindeki sitopatik etkileri değerlendirmek için her kültürdeki hücreleri hafif bir mikroskop üzerinde 40x hedefi altında karşılaştırın. Sitopatik etki tamamlandığında, hücre kültürü süpernatantlarını 15 milimetrelik bir tüpe ekleyin ve her kültürden hücresel kalıntıları santrifüjleme ile toplayın.
Daha sonra, netleştirilmiş virüs kültürü süpernatantını 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve soy virüslerini eksi 80 santigrat derece depolama için tek kullanımlık steril kriyojenik şişelere aktarın. Hücre enfeksiyonu için uygun hücre miktarını belirlemek için, hücreleri PBS ile yıkamadan ve 37 santigrat derecede üç mililitrede%0,25 Trypsin-EDTA per-flask içinde 45 dakikalık bir inkübasyonla hasat etmeden önce gösterildiği gibi 24 saat yaklaşık %80 izdiah MDCK hücre kültürleri hazırlayın. Hücreler ayrıldığında, şişe başına yedi mililitre taze kültür ortamı ile reaksiyona son ver ve her kültürden hücreleri say.
Hücreleri 4 kez 10 ila 5. E plakasının elektrotlarına dokunmadan her kuyuya 100 mikrolitre hücre kültürü ortamı eklemeden önce oda sıcaklığına birkaç dakika boyunca bir E-plaka yerleştirin. Beşiklerin kilidini açın ve plaka ön ucunun empedans ölçüm cihazının beşik cebine yerleştirin.
İnkübatörün kapısını kapatın ve yazılımı açın. Varsayılan Deneme Deseni Kurulumu'nda, seçili beşikleri vurgulayın ve denemenin adını girmek için üst sayfayı çift tıklatın. Düzen'i tıklatın ve plakanın seçilen her kuyusu için gerekli örnek bilgileri girin.
Zamanlama, Adımlar'ı tıklatın ve Adım Ekle'yi tıklatın. Yazılım otomatik olarak arka plan empedansını ölçmek için bir saniyelik bir adım ekler Yürüt ve Başlat, Devam Et'i tıklatın. Bir sonraki adıma geçmeden önce arka plan empedansının negatif 0,1 ile 0,1 arasında olduğunu onaylayarak uygun kuyuları seçmek için Çiz ve Ekle'yi tıklatın.
Daha sonra, plakayı beşikten çıkarın ve her hücre süspansiyonundan 100 mikrolitreyi kopya olarak uygun kuyulara ekleyin. E plakayı beşik cebine yüklemeden önce hücrelerin kuyuların altlarına düzgün bir şekilde dağıtılmasını sağlamak için E plakasını oda sıcaklığında 30 dakika boyunca laminar akış davlumbazında bırakın. Başlat, Devam'ı seçmeden önce Her 30 dakikada bir 200 tekrar için hücreleri izlemek üzere Zamanla ve Adım Ekle'yi tıklatın ve değerleri girin.
Hücre empedans verilerini kontrol etmek ve çizmek için Çiz'i tıklatın ve viral enfeksiyon sırasında hala büyüyen bir aşamada olan hücreleri elde etmek için tohumlamadan 24 saat sonra sabit aşamadan hemen önceki hücrelerin konsantrasyonunu seçin. CIT50 değerleri ile enfeksiyonun çokluğu arasındaki korelasyonu belirlemek, 4. taze bölünmüş MDCK hücrelerini 24 saat boyunca elektronik mikroter plakasının her kuyusuna 3 kez 10 kez kült ettikten sonra, hücreleri kuyu başına, yıkama başına 100 mikrolitre taze virüs yayılma ortamı ile iki kez yıkayın ve her kuyuya 100 mikrolitre viral süspansiyon eklemek için tek kanallı bir pipet kullanın. Tüm virüs seyreltmeleri eklendiğinde, plakayı 35 santigrat derecede cihazın beşik cebine hafifçe yükleyin ve gösterildiği gibi en az 100 saat boyunca her 15 dakikada bir hücre empedansını izlemeye başlayın.
İki ölçüm döngüsünden sonra, cihazı duraklatmak için tıklayın ve E plakasını beşikten çıkarın. Her kuyuya TPCK tripsin ile desteklenmiş 100 mikrolitre virüs yayma ortamı ekleyin ve E plakasını beşik cebine geri verin. O zaman analize başla.
İnfluenzayı değerlendirmek için A virüs hayatta kalma kinetiği, damıtılmış suda litre başına 35 gramlık nihai konsantrasyona sodyum klorür ekleyin ve elde edilen salin çözeltisinin 900 mikrolitresini iki mililitre kriyo tüplerine ekleyin. Her kriyo-tüpe 100 mikrolitre viral stok ekleyin ve tüpleri uygun deneysel zaman dilimi için 35 santigrat derecelik inkübatöre yerleştirin. Kuluçkanın bitiminden bir gün önce, tohum 3 kez 10 ila 4. taze bölünmüş MDCK hücreleri ve 16 kuyulu bir mikrotiter plakada kuyu başına 100 mikrolitre virüs yayılma ortamı tekrar adımlarla, arka plan empedansının ölçülebilmesini ve hücrelerin kuyuların dibine düzgün dağılımını sağlar.
Daha sonra hücreleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 24 saat boyunca büyütün. Ertesi gün, hücreleri iki kez yıkayın, daha sonra hücrelere gösterildiği gibi taze kültür ortamında 10 kez seyreltilmiş 100 mikrolitre salin damıtılmış virüs bulaştırır ve hücre empedansını her 15 dakikada bir en az 100 saat boyunca izler. Burada farklı konsantrasyonlarda MDCK hücreleri ile 120 saat sonra elde edilen ham veriler gösterilmiştir.
24 saat sonra, hücre indeksi ölçümleri, 3 kez 10 ila 4. MDCK hücre kültürleri, CIT50 ile influenza virüsünün enfeksiyonun ilk çokluğu arasında açık bir doğrusal ilişki olduğunu göstermektedir. Tipik bir sağkalım kinetik deneyinden elde edilen sonuçlar, virüs kaynaklı sitopatik etkiye bağlı olarak hücre indeksinde bir azalma olduğunu göstermektedir.
CIT50, çalışılan ortamda hangi virüsün en büyük stabiliteye sahip olduğunun belirlenmesi için her durumda her virüs için viral inaktivasyon eğimini hesaplamak için kullanılabilir. Virüsün stabilitesi dolaylı olarak inaktivasyon eğimi ile ilişkilidir ve örneğin, hemagglutinin glikoproteinde influenza A virüsü sağkalımında rol oynayan amino asit kalıntılarının tanımlanmasına izin verir. Bu teknik küçük varyasyonlara karşı çok hassastır.
Bu nedenle, deneyler arasında tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için otomatik bir hücre sayacı kullanılması teşvik edilir. Bu yöntem, farklı virüslerin replikasyonlarını karşılaştırmak, aynı anda birkaç hücre satırı için virüs tropizmini araştırmak veya virüs döngüsünün belirli adımlarını incelemek için de kullanılabilir.
