Methoden zur verschiedenen Partikelquantifizierung stellen einen kritischen Aspekt der meisten biologischen Studien dar. Dieses Protokoll ermöglicht eine präzise Quantifizierung der viralen Daten in Echtzeit. Diese Technik ersetzt die traditionelle Messung viraler Daten.
Durch objektive Echtzeitdaten liegen wir unter unserem Konfidenzintervall und vermeiden arbeitsintensive Endpunkte, die bewertet werden. Diese Methode kann für alle Viren verwendet werden, die eine zytopathische Wirkung induzieren. Das Verfahren wird Quentin Grassin, ein Labortechniker aus unserem Labor, demonstrieren.
Um H1N1-Viren zu vermehren und zu verstärken, säen Sie 7,5 mal 10 zu den 6 MDCK-Zellen auf zwei 75 Quadratzentimeter Großen Gewebekulturflaschen gemäß Standardprotokollen und inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius, um 90 bis 100% Konfluenz zu erreichen. Am nächsten Tag waschen Sie die Zellen zweimal mit fünf Millilitern sterilem PBS pro Kolben und Waschgang und beschriften Sie einen Kolben als Kontrolle. Anschließend wird eine aufgetaute Durchstechflasche mit Influenza-A-Virusmaterial in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen, das frisches Virusvermehrungsmedium enthält, auf die entsprechende experimentelle Konzentration verdünnt.
Verwenden Sie einen Milliliter des verdünnten Materials, um die MDCK-Zellen bei einer Vielzahl von Infektionen von 1 mal 10 bis zu den negativen 3 oder 1 mal 10 zu den negativen 4 plaquebildenden Einheiten pro Zelle zu infizieren, und fügen Sie einen Milliliter Virusvermehrungsmedium in den Kontrollkolben hinzu. Adsorbieren Sie das Virus für 45 Minuten bei Raumtemperatur an den Zellen, wobei alle 15 Minuten gerührt wird. Am Ende der Inkubation wird das Inokulum entfernt und durch 15 Milliliter Virusvermehrungsmedium ersetzt, das mit einem Mikrogramm pro Milliliter TPCK-Trypsin ergänzt wird, um die Spaltung von viralem Hämagglutinin HA0 in HA1- und HA2-Untereinheiten zu erleichtern.
Dann legen Sie den Kolben für drei Tage in den 35 Grad Celsius heißen Inkubator. Vergleichen Sie am Ende der Inkubation die Zellen in jeder Kultur unter einem 40-fachen Objektiv auf einem Lichtmikroskop, um die zytopathischen Wirkungen auf die Zellen zu beurteilen. Wenn der zytopathische Effekt abgeschlossen ist, fügen Sie die Zellkulturüberstände zu einem 15-Millimeter-Röhrchen hinzu und sammeln Sie die Zelltrümmer aus jeder Kultur durch Zentrifugation.
Dann übertragen Sie den geklärten Viruskulturüberstand in ein 15-Milliliter-Röhrchen und aliquotieren Sie die Nachkommenviren zu sterilen kryogenen Einwegfläschchen für eine Lagerung von minus 80 Grad Celsius. Um die geeignete Zellmenge für die Zellinfektion zu bestimmen, bereiten Sie 24 Stunden lang etwa 80% konfluente MDCK-Zellkulturen vor, wie nachgewiesen, bevor Sie die Zellen mit PBS waschen und mit einer 45-minütigen Inkubation in drei Millilitern 0,25% Trypsin-EDTA pro Kolben bei 37 Grad Celsius ernten. Wenn sich die Zellen abgelöst haben, stoppen Sie die Reaktion mit sieben Millilitern frischem Kulturmedium pro Kolben und zählen Sie die Zellen aus jeder Kultur.
Verdünnen Sie die Zellen auf 4 mal 10 bis 5. Zellen pro Milliliter Zellkulturmedium und führen Sie zweifache serielle Verdünnungen der Zellen wie angegeben durch. Legen Sie eine E-Platte für einige Minuten bei Raumtemperatur auf, bevor Sie 100 Mikroliter Zellkulturmedium in jede Vertiefung geben, ohne die Elektroden der E-Platte zu berühren. Entriegeln Sie die Halterungen und stecken Sie das vordere Ende der Platte in die Halterungstasche des Impedanzmessgeräts.
Schließen Sie die Tür des Inkubators und öffnen Sie die Software. Markieren Sie im Standard-Experimentmuster-Setup die ausgewählten Dockingstationen, und doppelklicken Sie auf die obere Seite, um den Namen des Experiments einzugeben. Klicken Sie auf Layout und geben Sie die erforderlichen Probeninformationen für jede ausgewählte Vertiefung der Platte ein.
Klicken Sie auf Zeitplan, Schritte und Schritt hinzufügen. Die Software fügt automatisch einen einsekündigen Schritt hinzu, um die Hintergrundimpedanz zu messen Klicken Sie auf Ausführen und Starten, Weiter. Klicken Sie auf Plotten und Hinzufügen, um die entsprechenden Vertiefungen auszuwählen, und vergewissern Sie sich, dass die Hintergrundimpedanz zwischen minus 0,1 und 0,1 liegt, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
Als nächstes entfernen Sie die Platte aus der Halterung und geben Sie 100 Mikroliter jeder Zellsuspension in die entsprechenden Vertiefungen in doppelter Ausfertigung. Lassen Sie die E-Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur in der Laminar-Flow-Haube, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen auf den Boden der Vertiefungen zu ermöglichen, bevor Sie die E-Platte in die Wiegetasche laden. Klicken Sie auf Zeitplan und Schritt hinzufügen und geben Sie Werte ein, um die Zellen alle 30 Minuten auf 200 Wiederholungen zu überwachen, bevor Sie Start und Weiter auswählen.
Um die Zellimpedanzdaten zu überprüfen und aufzuzeichnen, klicken Sie auf Plot und wählen Sie die Zellkonzentration aus, die sich 24 Stunden nach dem Seeding kurz vor der stationären Phase befindet, um Zellen zu erhalten, die sich während der Virusinfektion noch in einer Wachstumsphase befinden. Um die Korrelation zwischen den CIT50-Werten und der Vielzahl der Infektion zu bestimmen, waschen Sie die Zellen nach der Kultivierung von 3 mal 10 bis 4. frisch gespaltenen MDCK-Zellen in jede Vertiefung der elektronischen Mikrotiterplatte für 24 Stunden zweimal mit 100 Mikrolitern frischem Virusvermehrungsmedium pro Vertiefung und pro Wäsche und verwenden Sie eine Einkanalpipette, um 100 Mikroliter Virussuspension in jede Vertiefung zu geben. Wenn alle Virusverdünnungen hinzugefügt wurden, laden Sie die Platte vorsichtig bei 35 Grad Celsius in die Cradle-Tasche des Instruments und beginnen Sie, die Zellimpedanz alle 15 Minuten für mindestens 100 Stunden zu überwachen, wie gezeigt.
Klicken Sie nach zwei Messzyklen, um das Gerät anzuhalten, und entfernen Sie die E-Platte aus der Dockingstation. Fügen Sie 100 Mikroliter Virusvermehrungsmedium, ergänzt mit TPCK-Trypsin, zu jeder Vertiefung hinzu und geben Sie die E-Platte in die Wiegetasche zurück. Starten Sie dann die Analyse.
Um die Überlebenskinetik des Influenza-A-Virus zu beurteilen, fügen Sie Natriumchlorid zu einer Endkonzentration von 35 Gramm pro Liter in destilliertem Wasser hinzu und geben Sie 900 Mikroliter der resultierenden Kochsalzlösung zu Zwei-Milliliter-Kryoröhren hinzu. Fügen Sie jedem Kryoröhrchen 100 Mikroliter Virusmaterial hinzu und legen Sie die Röhrchen für den entsprechenden Versuchszeitraum in den 35 Grad Celsius heißen Inkubator. Am Tag vor dem Ende der Inkubation säen Sie 3 mal 10 bis 4. frisch gespaltene MDCK-Zellen und 100 Mikroliter Virusvermehrungsmedium pro Vertiefung in einer 16-Well-Mikrotiterplatte in Wiederholungsschritten, um die Messung der Hintergrundimpedanz und gleichmäßigen Verteilung der Zellen auf den Boden der Vertiefungen zu ermöglichen.
Dann wachsen die Zellen für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag zweimal, infizieren Sie die Zellen dann mit 100 Mikrolitern des kochsalzdestillierten Virus, das 10-mal in frischem Kulturmedium verdünnt wird, wie gezeigt, und überwachen Sie die Zellimpedanz alle 15 Minuten für mindestens 100 Stunden. Hier werden Rohdaten gezeigt, die nach 120 Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen von MDCK-Zellen gewonnen wurden.
Nach 24 Stunden zeigten Zellindexmessungen, dass sich Zellen in Vertiefungen, die mit 3 mal 10 bis 4 Zellen ausgesät waren, noch in der exponentiellen Wachstumsphase befanden, daher wurde diese Zellkonzentration für nachfolgende Experimente verwendet. MDCK-Zellkulturen zeigen eine klare lineare Beziehung zwischen dem CIT50 und der anfänglichen Vielzahl von Infektionen durch influenzavirales Virus. Die Ergebnisse eines typischen kinetischen Überlebensexperiments zeigen eine Abnahme des Zellindex aufgrund der virusinduzierten zytopathischen Wirkung.
Der CIT50 kann verwendet werden, um die virale Inaktivierungssteigung für jedes Virus in jedem Zustand zu berechnen, um festzustellen, welches Virus die größte Stabilität in der untersuchten Umgebung hatte. Die Stabilität des Virus korreliert indirekt mit der Inaktivierungssteigung, so dass beispielsweise Aminosäurereste im Hämagglutininglykoprotein identifiziert werden können, die am Überleben des Influenza-A-Virus außerhalb des Wirts beteiligt sind. Diese Technik reagiert sehr empfindlich auf kleine Variationen.
Daher wird die Verwendung eines automatischen Zellzählers empfohlen, um reproduzierbare Ergebnisse zwischen den Experimenten zu erhalten. Diese Methode kann auch verwendet werden, um die Replikation verschiedener Viren zu vergleichen, den Virustropismus für mehrere Zelllinien gleichzeitig zu untersuchen oder bestimmte Schritte des Viruszyklus zu untersuchen.
