Aquí describimos un flujo de trabajo simple basado en Fiji de código abierto llamado Worm-align, que se puede utilizar para generar montajes de un solo canal o multicanal de gusanos enderezados de interés a partir de imágenes de microscopía crudas. Dado que este flujo de trabajo se basa en animales de interés seleccionados por el usuario, podría ser particularmente útil al analizar imágenes de C.elegans donde los gusanos no están todos en la etapa o condición correcta. Cabe señalar que la salida de Worm-align puede utilizarse para la cuantificación posterior de la fluorescencia con Fiji u otro software de análisis de imágenes.
Aquí demostramos la cuantificación de la fluorescencia utilizando la tubería CellProfiler Worm_CP. Comience creando una micropipeta de boca extendiendo un capilar de vidrio delgado en la llama de un quemador Bunsen. Después de la extensión en la llama, romper el capilar en dos piezas si no se rompió en dos pedazos después de la extensión.
Si se rompió en dos pedazos, corte el final de la más larga. Seleccione la pieza más larga y compruebe si el capilar está abierto intentando aspirar agua. Separe el adaptador de un tubo de silicona de tres milímetros.
Enchufe el capilar de vidrio en un adaptador capilar conectado a un tubo de silicona de seis milímetros. A continuación, conecte el otro extremo del tubo de seis milímetros en un filtro de 0,2 micrómetros y un tubo de silicona de tres milímetros en su otro extremo. Enchufe una punta de filtro de un milímetro en el extremo libre del tubo de silicona de tres milímetros para aspirar líquido.
Bajo un microscopio de disección, retire la mayor cantidad de líquido posible alrededor de un pellet de gusanos fijos con la micropipeta de la boca. Agregue rápidamente 10 microlitros de medio de montaje en la parte inferior del tubo. Enjuague una punta de 10 microlitros en PBS con rastros de detergente para evitar que los gusanos se peguen a los lados de la punta de la pipeta de plástico.
A continuación, cortar el extremo de la punta con un par de tijeras. Transfiera ocho microlitros de medio de montaje con los gusanos a una almohadilla de agarosa previamente preparada. Mientras observa la diapositiva bajo el microscopio, agite suavemente para evitar la superposición de los gusanos.
A continuación, cubra la caída del medio de montaje en la almohadilla de agarosa con un cubreobjetos de 18 por 18 milímetros. Para montar gusanos vivos, pipetee de tres a cuatro microlitros de tres levamisoles milimolar disueltos en M9 sobre una almohadilla de agarosa. Escoja de 30 a 50 gusanos por condición en la gota de levamisol.
A continuación, cubra la gota con un cubreobjetos de 18 por 18 milímetros e imagine los gusanos en una hora. Instale el paquete de software de análisis de imágenes de código abierto Fiji desde ImageJ, o si ya está instalado en el equipo, compruebe que es la versión 1.52A o posterior y, a continuación, descargue el repositorio Worm-align desde GitHub y guárdelo en el equipo. Una vez que todos los componentes de canalización se han descargado e instalado, abra Fiji y ejecute la macro Worm-align haciendo clic en plugins, macros y ejecutándose en la barra de menú principal.
Localice la alineación de gusanos. ijm script y haga clic en abrir. Navegue a la carpeta de entrada con las imágenes que se analizarán y haga clic en seleccionar, asegurándose de que la carpeta seleccionada solo contenga archivos de imagen.
La macro generará automáticamente una carpeta de salida donde se guardarán todos los resultados. El nombre de la carpeta será el mismo que la carpeta de entrada con la salida como un post-fix. Permita que la macro abra la primera imagen en la carpeta de entrada y utilízala como imagen representativa para extraer los ajustes necesarios para generar el montaje, incluido el ancho de los gusanos, el brillo y el contraste.
Con la herramienta de dibujo de línea recta, dibuje una línea a lo largo del ancho de un gusano y haga clic en Aceptar. Utilice la longitud de esta línea para determinar la altura de las regiones recortadas para gusanos individuales. Para cada canal, especifique el nombre, la tabla de búsqueda y si debe incluirse en el montaje y, a continuación, haga clic en Aceptar. A continuación, ajuste los ajustes de brillo y contraste de los canales mediante los controles deslizantes. Repita este proceso para los canales restantes.
Una vez configuradas todas las opciones, se registrarán en una tabla de configuración y se guardarán en la subcarpeta CellProfiler de la carpeta de salida. Se genera una imagen para mostrar cómo se verán todas las imágenes después de la aplicación de la configuración. Si la imagen es satisfactoria, marque la casilla superior.
La segunda y tercera casilla del panel Comprobar todos los ajustes especifican las opciones para la generación de montajes. Deje ambas casillas marcadas y haga clic en Aceptar para ejecutar el resto de la macro. Si no marca la casilla superior, la macro volverá a ejecutar la configuración.
A continuación, la macro procede a abrir todas las imágenes de la carpeta de entrada. Para cada imagen, dibuje líneas en el eje longitudinal de todos los gusanos que se incluirán en el montaje utilizando la herramienta segmentada o la herramienta de línea a mano alzada. Dibuje líneas de forma consistente de cabeza a cola o viceversa a lo largo de toda la longitud de los gusanos y agregue cada línea al administrador de ROI haciendo clic en Control T.Una vez que se hayan agregado todos los gusanos deseados, haga clic en Aceptar. Worm-align generará imágenes recortadas de gusanos seleccionados individuales, que se guardarán en la subcarpeta de gusano único de la carpeta de salida.
Los montajes de todos los gusanos seleccionados se guardarán en la carpeta alineada. Descargue e instale CellProfiler 2.2.0 haciendo clic en el vínculo de las versiones anteriores de CellProfiler en la página de descarga y seleccionando el sistema operativo necesario. Antes de iniciar la canalización de Worm_CP, asegúrese de que todas las imágenes de salida esperadas estén presentes en la subcarpeta CellProfiler de la carpeta de salida Worm-align.
Debe haber una copia procesada de la imagen original, una máscara de imagen binaria de la población de gusanos, alinear la máscara si la línea se dibuja en gusanos seleccionados y debe estar presente una imagen que represente cada uno de los canales de la imagen original. Abra CellProfiler, luego haga clic en el módulo de entrada de imágenes y arrastre la carpeta del módulo CellProfiler a la ventana que dice soltar archivos y carpetas aquí. Si hay una lista de imágenes de un análisis anterior, primero elimínelas haciendo clic con el botón derecho en la ventana y seleccionando Borrar lista de archivos.
Haga clic en el módulo de entrada de metadatos y, en el segundo método de extracción, haga clic en la carpeta amarilla y vaya a la subcarpeta CellProfiler de la carpeta de salida Worm-align. Seleccione el archivo de configuración y, a continuación, haga clic en Actualizar. A continuación, haga clic en el módulo de entrada de nombres y tipos y asegúrese de que todas las imágenes necesarias para la canalización están presentes.
Antes de ejecutar la canalización, seleccione un destino para los resultados de salida en el módulo de salida. Utilice el modo de prueba para ver el rendimiento de la canalización haciendo clic en el modo de prueba de inicio y permita que se ejecute a través de la primera imagen de la carpeta. Cuando esté satisfecho con el rendimiento de la canalización, haga clic en salir del modo de prueba y analice las imágenes.
Antes de comenzar el análisis, asegúrese de que todos los ojos delante del módulo de análisis estén cerrados. Una vez completado el análisis, abra la carpeta de salida Worm_CP que consta de dos archivos CSV, gusanos CSV y líneas CSV. Cultivar e tomar imágenes de C.elegans según el método descrito en este protocolo produce grandes imágenes de visión general de las poblaciones de gusanos.
La salida de la canalización depende en gran medida de la calidad de las líneas dibujadas en la parte superior de las imágenes. Varios ejemplos de línea y su salida de Worm-align se muestran aquí. Cuando se utiliza el script Worm-align, la identificación visual de gusanos intersectantes es posible a partir de las imágenes de superposición que se encuentran en la subcarpeta de datos, así como de los paneles de gusanos individuales en el montaje.
La tabla de control de calidad también se puede utilizar para identificar gusanos superpuestos. Sin embargo, las líneas de intersección son problemáticas para la canalización de Worm_CP. Esto se debe a que Worm_CP utiliza máscara de línea, no regiones de interés, para ayudar a identificar gusanos individuales.
Por lo tanto, CellProfiler segmentará uno de los gusanos como dos objetos. El Worm_CP tubería se ha utilizado para cuantificar la intensidad de la fluorescencia de animales fijos etiquetados con un tinte fluorescente que se incorpora en las gotas de lípidos. El contenido de gotas de lípidos se reduce en un 17% entre los animales DBL1 de tipo salvaje y mutantes mediante cuantificación manual, y en un 12% utilizando el Worm_CP tubería.
Worm_CP también se utilizó para cuantificar la respuesta de choque térmico en gusanos vivos que expresan la GFP bajo el control de un gen inducible por choque térmico. En ausencia de estrés por calor, los gusanos no indujeron la expresión de la GFP. Cuando los gusanos se exponen como un choque térmico corto, se induce la expresión de GFP.
La salida de Worm_CP depende en gran medida de la calidad de las líneas que dibuje con Worm-align. Asegúrese de que sus líneas no se toquen o se superpongan y dibuje todas las líneas en la misma dirección. Comprobar la tabla de control de calidad puede ayudarle a identificar las líneas que se están tocando o superponiendo para que pueda excluir esos casos del análisis.
La salida de Worm-align se puede utilizar para la cuantificación posterior en Fiji o en otros paquetes de software de análisis de imágenes. Hemos mostrado aquí una canalización CellProfiler muy básica en la que otros módulos de análisis podrían incorporarse muy fácilmente, por ejemplo, para contar el número de gotas de lípidos o para cuantificar la intensidad de las gotas individuales dentro de un gusano. Una de las ventajas de esta técnica es la posibilidad de cuantificar rápidamente la fluorescencia de gusanos individuales.
En nuestro laboratorio, tenemos un interés en la viabilidad individual utilizando reporteros de fluorescencia y utilizamos Worm-align y Worm_CP rutinariamente para este propósito.
