Los autores desean agradecer a Nilou Sarah Arden y Zhong Zhao por su revisión constructiva de este manuscrito. Los autores también desean agradecer a Lindsey Brown por sus aportes esenciales durante este proyecto. El financiamiento interno parcial y el apoyo para este trabajo fueron proporcionados por el Programa de Ruta Crítica de CDER (CA # 1-13) y el Programa de Excelencia del Centro de Innovación y Ciencia de Fabricación de CDER (Berilla-CoE-19-49). Este proyecto fue apoyado en parte por el Programa de Pasantías / Participación en Investigación en la Oficina de Productos Biotecnológicos, Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos, administrado por el Instituto Oak Ridge para la Ciencia y la Educación a través de un acuerdo interinstitucional entre el Departamento de Energía de los Estados Unidos y la FDA.
Esta publicación refleja los puntos de vista del autor y no debe interpretarse como una representación de los puntos de vista o políticas de la FDA.

1. Preparación de AWS
NOTA: Este protocolo fue desarrollado utilizando una cámara acustoforética. Sin embargo, el AWS a escala de banco tiene cinco sondas de turbidez que pueden operar 4 cámaras acustoforéticas en serie si es necesario.
<ol><li>Conecte los cables de turbidez en sus respectivos puertos etiquetados como F, 1, 2, 3, 4 (por ejemplo, la sonda de turbidez 1 en la Figura 1c y el puerto 1 en la Figura 2a)y los cables BNC de alimentación de la cámara a la parte posterior del sistema AWS etiquetados como 1, 2, 3, 4(Figura 2b). NOTA: No conecte el otro extremo del cable BNC de alimentación de la cámara (Figura 3c) a la parte posterior de la cámara acustoforética (Figura 3d) hasta el paso 2.6 cuando la cámara esté llena de líquido. Si la alimentación de la cámara se enciende sin líquido en la cámara, dañará el transductor piezoeléctrico de la cámara y dejará de funcionar.</li>
	<li>Inserte las sondas de turbidez en el medidor de turbidez y la carcasa del termómetro y apriete los tornillos(Figura 1c y Figura 3).</li>
	<li>Conecte el tubo de alimentación a la entrada del puerto de turbidez de alimentación (Figura 4a) a través de la bomba de alimentación (Figura 1b a 1c).</li>
	<li>Conecte el tubo en Y desde la salida del puerto de turbidez de alimentación(Figura 4b)a los puertos de entrada de la cámara acustoforética(Figura 4c).</li>
	<li>Conecte el tubo de la etapa 1 desde el puerto de desechos de la cámara acustoforética (Figura 4d) a través de la bomba de la etapa 1 a un recipiente de recolección de celdas (Figura 1d a través de 1e a 1f).</li>
	<li>Conecte el tubo desde el puerto de permeado de la cámara acustoforética (Figura 4e) a la entrada del puerto de turbidez de la sonda1 (Figura 4f).</li>
	<li>Conecte el tubo de cosecha desde fuera del puerto de turbidez de la sonda1 (Figura 4g) a un recipiente de recolección de productos (Figura 1c a 1g).</li>
</ol>2. Prepara el sistema con HCCF
NOTA: Este protocolo se desarrolló utilizando células CHO-K1 cultivadas en un medio definido químicamente (ActiCHO P con 6 mM L-glutamina) produciendo el modelo de anticuerpo monoclonal IgG1 VRC0113 y puede necesitar ser ajustado para otras líneas celulares y productos. El HCCF utilizado en este protocolo se obtuvo al final de 7-8 días de cultivos CHO-K1 a partir de un matraz agitador o un proceso de biorreactor.
<ol><li>Encienda el AWS activando los interruptores de encendido en la parte posterior y delantera del AWS.</li>
	<li>Encienda la computadora y haga doble clic en el icono del escritorio para el software asociado (consulte tabla de materiales). Desde el panel "Lecturas", pulse el botón "Iniciar prueba" para iniciar la grabación de datos(Figura 5). Una vez que se inicia el registro de datos, todos los datos recopilados se registrarán en una hoja de cálculo exportable hasta que se detenga la prueba.</li>
	<li>Conecte el extremo del tubo de alimentación en el recipiente HCCF que se está agitando.</li>
	<li>Inicie la bomba de alimentación introduciendo la velocidad de la bomba en la pantalla "Controles" dentro de la " Imagen de labomba de alimentación" y pulse "Intro" en el teclado. Asegúrese de que el "Icono de flecha de direcciónde la bomba " (en el sentido de las agujas del reloj o en el sentido contrario a las agujas del reloj) esté correctamente seleccionado en el cuadro gris a la derecha de la imagen de la bomba de alimentación para bombear HCCF desde el recipiente a la cámara acustoforética. Haga clic en el "Icono detriángulo " junto a las palabras "Encender" dentro del cuadro gris debajo de la imagen de la bomba de alimentación para "Iniciar" la bomba (Figura 6a). NOTA: La velocidad máxima de la bomba es de 10 L/h (167 mL/min), pero se recomienda que el caudal nominal, 60 mL/min, se utilice para este paso para llenar rápidamente la tubería y la cámara sin correr el riesgo de llenar en exceso la cámara antes de comenzar la separación.</li>
	<li>Monitoree las mediciones de turbidez de alimentación observando el "Panel de Reducción porcentual" ( Figura5c) durante el llenado de la cámara acustoforética. Los valores de turbidez se mantendrán constantes durante la carga de la cámara si el HCCF se mezcla lo suficiente en el recipiente HCCF.</li>
	<li>Una vez que el líquido esté por encima del transductor piezoeléctrico en la parte posterior de la cámara acustoforética, presione "Apagar" dentro de la caja gris debajo de la imagen de la bomba de alimentación para detener la bomba. Conecte el cable de alimentación BNC (Figura 3c) a la cámara acustoforética (Figura 3d). NOTA: El volumen de retención de cada cámara acustoforética es de alrededor de 190 ml.</li>
</ol>3. Funcionamiento de AWS
<ol><li>Una vez que la cámara acustoforética esté llena y el cable de alimentación BNC esté conectado a la parte posterior de la cámara acustoforética, cambie la velocidad de la bomba de alimentación a la velocidad de funcionamiento deseada(Figura 6a y Tabla 1). Se deben probar varias velocidades de bomba de alimentación para identificar los parámetros de funcionamiento ideales para un proceso determinado.</li>
	<li>Encienda la potencia piezoeléctrica del escenario1 deslizando la barra del módulo de alimentación a 10 W(Figura 6d)y presionando el icono "Encender "en el lado derecho del cuadro del Escenario 1(Figura 6c). Según lo sugerido por el fabricante, use 10 W, la configuración de potencia recomendada para las celdas CHO. Esto generará una frecuencia fija de 2 MHz para su operación. Después de varios segundos, las células comenzarán a agruparse visiblemente en los nodos de onda en la cámara acustoforética(Figura 7a).</li>
	<li>Una vez que las células comienzan a asentarse en el fondo de la cámara acustoforética(Figura 7b),inicie la bomba de etapa 1 con una velocidad adecuada basada en la densidad de la celda y la velocidad de la bomba de alimentación(Figura 6b). Sobre la base de la hoja de cálculo de optimización y operación de estado estacionario del fabricante, la velocidad de la bomba de la etapa 1 se puede calcular en función de la masa de la celda empaquetada y la tasa de flujo de alimentación utilizando la siguiente ecuación <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ01.jpg"><ol>
<li>Para calcular la masa celular empaquetada, tara una escala con un tubo vacío de 15 ml (u otro tubo compatible con centrifugación). Llene el tubo con material de alimentación y registre el peso total del tubo con alimentación. Centrifugar el tubo durante 10 min a 3.700 x g. Decanta el sobrenadante en un recipiente separado. Mida el peso del tubo con el pellet celular. El porcentaje de masa celular empaquetada de la materia prima de alimentación = (peso del tubo decantado/peso del tubo lleno) x 100%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monitorizar el perfil de turbidez de la turbidez en estadio1 a medida que el desbordamiento de la cámara acustoforética entra en la sonda de turbidez1 (Figura 8).</li>
	<li>A medida que la separación celular continúe, la eficiencia de la eliminación celular <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ02.jpg"> aumentará.</li>
	<li>Además, controle la diferencia de temperatura entre la alimentación y la etapa1, ya que aumentará a medida que continúe la separación celular(Figura 9). La temperatura puede aumentar cuando se utiliza una alimentación de mayor densidad celular, pero generalmente se puede reducir alterando la tasa de flujo de alimentación. NOTA: Cuando se utilizan múltiples cámaras acustoforéticas, se puede conectar secuencialmente el tubo de la cámara acustoforética anterior a través de sondas de turbidez a la entrada de la cámara acustoforética actual. Además, se puede conectar el tubo de etapa desde el fondo de las cámaras acustoforéticas a través de bombas de etapa a los recipientes de recolección de células. Un total de cuatro cámaras acustoforéticas se pueden conectar en serie para una eficiencia óptima de eliminación celular si es necesario.</li>
</ol>4. Finalización de AWS
<ol><li>Cuando termine la carrera, detenga la alimentación y la bomba de la etapa 1 presionando Apagar dentro de la caja gris debajo de la bomba de alimentación y las imágenes de la bomba de la etapa 1, respectivamente, para detener las bombas.</li>
	<li>Apague la alimentación de la cámara presionando Apagar en el lado derecho de la caja de la Etapa 1 y desconecte el cable de alimentación BNC.</li>
	<li>Tome el material de cosecha del producto recolectado para procedimientos de clarificación y purificación adicionales, como métodos de filtración en profundidad y cromatografía. Deseche el material de cosecha celular.</li>
	<li>Drene el líquido restante en la cámara acustoforética colocando el tubo de desechos en un recipiente vacío, desconectando el tubo de la entrada de la cámara acustoforética y los puertos de permeo y liberando el tubo de desecho del cabezal de la bomba.</li>
	<li>Vuelva a conectar el tubo, vuelva a colocar el tubo de desecho en el cabezal de la bomba y fluya a través del agua DI desde el extremo del tubo de alimentación utilizando una velocidad de bomba de alimentación de 60 ml / min y una velocidad de bomba de etapa 1 de 60 ml / min. Continúe durante 15-20 minutos. Descarta el flujo a través.</li>
	<li>Bombee alcohol isopropílico (IPA) al 70% a través del tubo y la cámara utilizando la bomba de alimentación durante 15-20 min. Descarta el flujo a través.</li>
	<li>Repita el procedimiento de limpieza con agua DI para limpiar los tubos y la cámara utilizando la bomba de alimentación durante 15-20 min. Descarta el flujo a través.</li>
	<li>Desmonte el tubo de las sondas de turbidez y cámaras acustoforéticas y limpie el área con 70% de IPA.</li>
	<li>Desmonta las sondas de turbidez y limpia el interior de las sondas de turbidez con un 70% de IPA. Deje que todas las piezas se sequen al aire y luego vuelva a ensamblarlas para el siguiente uso. NOTA: Las cámaras acustoforéticas se fabrican para un solo uso, pero se pueden reutilizar si se manipulan y limpian adecuadamente como se describe en este protocolo.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Roush, D. J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+primary+recovery:+centrifugation+and+membrane+technology.">Advances in primary recovery: centrifugation and membrane technology.</a> Biotechnology Progress. 24 (3), 488-495 (2008).</li><li>Hutchinson, N., Bingham, N., Murrell, N., Farid, S., Hoare, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+analysis+of+mammalian+cell+suspensions+for+prediction+of+industrial+centrifugation+and+its+verification.">Shear stress analysis of mammalian cell suspensions for prediction of industrial centrifugation and its verification.</a> Biotechnology and Bioengineering. 95 (3), 483-491 (2006).</li><li>Shukla, A. 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M., Smith, L., Dedinsky, B., Persson, B., Piret, J. 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Z., Lanthier, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+cell+filter:+a+proven+cell+retention+technology+for+perfusion+of+animal+cell+cultures.">Acoustic cell filter: a proven cell retention technology for perfusion of animal cell cultures.</a> Biotechnology Advances. 22 (6), 433-444 (2004).</li><li>Wolf, M. K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Performance+in+Mammalian+Cell+Perfusion+Cultures+by+Growth+Inhibition.">Improved Performance in Mammalian Cell Perfusion Cultures by Growth Inhibition.</a> Biotechnology Journal. 14 (2), 1700722 (2019).</li><li>Lin, H., Leighty, R. W., Godfrey, S., Wang, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+approach+to+developing+mammalian+cell+culture+media+for+high+cell+density+perfusion+process+leveraging+established+fed-batch+media.">Principles and approach to developing mammalian cell culture media for high cell density perfusion process leveraging established fed-batch media.</a> Biotechnology Progress. 33 (4), 891-901 (2017).</li><li>Emily, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+clarification+of+very+high+cell+density+cell+culture+harvest+by+enhanced+cell+settling.">Primary clarification of very high cell density cell culture harvest by enhanced cell settling.</a> BioProcess International. 8, 32-39 (2010).</li></ol>

Los autores no tienen intereses financieros en los productos descritos en este manuscrito y no tienen nada más que revelar.

Se describe un protocolo paso a paso para la implementación de un AWS a escala de banco en la clarificación primaria de un modelo de anticuerpo monoclonal de HCCF de una línea celular CHO. Como se muestra en los resultados representativos, el uso de AWS en la clarificación primaria dio como resultado una aclaración de celdas y una recuperación del producto efectivas. Además, el bajo nivel de mantenimiento y los requisitos operativos y la capacidad de ampliación permiten un mayor potencial de aplicación en la aclaración primaria.
Es importante destacar que los resultados representativos sugieren que la velocidad de la bomba de alimentación es crítica para la separación de las células. Además, debido a las limitaciones en la detección de alta densidad celular en la medición de la turbidez, la densidad de la célula de trabajo es otro factor a considerar al utilizar un sistema AWS. Debido a que la sonda de turbidez estará saturada cuando se ejecute material de alimentación de alta densidad celular, puede ser mejor calcular la eficiencia de separación celular midiendo las densidades celulares del material de alimentación y el fluido de cultivo celular clarificado fuera de línea. Con una medición precisa de la clarificación fuera de línea, una estrategia de proceso que se puede considerar para resolver estos problemas es usar múltiples cámaras en serie. Aunque este protocolo se centra principalmente en el uso de una sola cámara, este sistema puede operar tres cámaras adicionales para la clarificación secuencial de las células que pueden afectar mínimamente la condición de las células y dar como resultado una alta recuperación del producto. Además, otros parámetros, como la potencia para AWS y los caudales de eliminación de celdas, se pueden optimizar aún más para tipos de celdas o modos de operación específicos. En general, se recomienda una optimización de los parámetros de operación y la estrategia utilizando estas consideraciones antes de la implementación de AWS.
Entre muchos potenciales de aplicación, el uso de AWS en el bioprocesamiento continuo es prometedor. Debido a que AWS puede reemplazar la centrifugación y reducir drásticamente el área de superficie del filtro14,el uso de AWS permitiría un flujo constante de material libre de células para los procesos posteriores de filtración y cromatografía que son compatibles con la biofabricación continua. Debido a esta compatibilidad y a la disponibilidad de la tecnología de perfusión para una alta densidad celular (por ejemplo, >50 x 106 células/ml) y una mayor duración del cultivo (por ejemplo, >14 días), AWS tiene el potencial de desarrollar una nueva estrategia de sangrado celular continuo además de la clarificación primaria.
En algunos casos, hasta el 30% de la proteína terapéutica producida se elimina durante la operación en estado estacionario en el material de sangrado celular15,16. Además, para que los anticuerpos monoclonales eliminados se agrupen con el material cosechado estándar, se deben cumplir ciertos atributos de calidad. Cuando no se cumplen estas especificaciones, el resultado puede ser un rechazo del material que puede afectar el rendimiento del producto. Para compensar dicha pérdida de producto, se puede implementar una clarificación continua del material de sangrado celular utilizando AWS en una condición de estado estacionario durante un proceso de perfusión a largo plazo17. Esta estrategia puede reducir la pérdida de producto en el material de sangrado y utilizar más de la proteína producida. Además, las celdas después de la clarificación continua mediante AWS podrían volver a agregarse al biorreactor si se desea para una mayor densidad celular y productividad. Por lo tanto, la clarificación continua del material de purga celular con AWS puede ofrecer una oportunidad para aumentar el rendimiento y/o disminuir el área de superficie del filtro secundario en un proceso determinado.
En resumen, la utilidad de AWS no se limita a una simple aclaración primaria, sino que puede tener utilidad para aplicaciones en bioprocesamiento continuo que puede mejorar la tasa de fabricación y la flexibilidad operativa.

Un paso crítico en un proceso de biofabricación que involucra proteínas terapéuticas secretadas es la eliminación de biomasa del fluido de cultivo celular cosechado (HCCF). Tradicionalmente, los biofabricantes han adoptado la centrifugación seguida de la filtración en profundidad como sus principales métodos de clarificación en la producción de anticuerpos monoclonales1. Sin embargo, la centrifugación puede conducir a un alto estrés cortante en las células, lo que resulta en un aumento de los desechos celulares en el HCCF. Esto puede conducir potencialmente a ensuciamiento del filtro durante la filtración y dar lugar a contaminantes adicionales después de la filtración que posteriormente pueden reducir la eficiencia de la cromatografía aguasabajo 1,2,3. Además, la personalización de las centrifugadoras para un determinado proceso puede ser costosa y puede requerir conexiones adicionales a sistemas de limpieza in situ y esterilización in situ que también pueden ser un factor limitante para la escalabilidad. El uso de filtros de profundidad puede compensar las limitaciones de la centrifugación y también aprovechar la tecnología de un solo uso4. Sin embargo, los filtros de profundidad se utilizan principalmente como clarificación secundaria porque no pueden soportar altas densidades de cultivo celular5. Alternativamente, se han empleado dispositivos de retención celular de filtración de flujo tangencial (TFF) para mitigar el estrés cortante, pero pueden experimentar desafíos como la polarización de la membrana y los bajos rendimientos de cosecha6. Los problemas anteriores que surgen del uso de la centrifugación más la filtración de profundidad o TFF crean una oportunidad para la mejora del proceso de clarificación primaria de HCCF.
La separación acústica se introdujo como una tecnología que se puede utilizar para cosechar proteínas secretadas de cultivos celulares con productos proteicos de alta calidad7,8. La separación acústica se logra a través de la propagación y reflexión de ondas estacionarias multidimensionales que interactúan con fluidos suspendidos y partículas retenidas9,10. Estas partículas experimentan tres fuerzas: arrastre de fluidos, gravedad y radiación acústica. Cuando cada una de las fuerzas se oponen por igual entre sí, alcanzando el equilibrio, las partículas quedan suspendidas y atrapadas dentro de la onda estacionaria ultrasónica10. En una suspensión de cultivo celular, las células se mantienen dentro de este plano de nodo de presión de ondas estacionarias, el nodo crece a medida que las células se fusionan y, finalmente, estos grupos de nodos celulares caen de la fuerza gravitacional9. Estas células sedimentadas se eliminan de los medios, lo que permite que los medios clarificados se bombeen para su posterior procesamiento aguas abajo. La utilización de ondas ultrasónicas como método de separación ha comenzado a traducirse en aplicaciones biológicas que van desde la separación de partículas lipídicas y glóbulos rojos11 hasta el cultivo celular de perfusión de mamíferos12. Con sus capacidades relativas para reducir los costos, la mano de obra y el estrés celular al evitar la centrifugación, la filtración en profundidad o TFF, los biofabricantes están explorando las aplicaciones potenciales del uso de la separación acústica.
Este estudio proporciona un protocolo general para operar un separador de ondas acústicas (AWS) de sobremesa para la clarificación del cultivo celular CHO, presenta datos representativos y demuestra cómo lograr una clarificación celular efectiva y la recuperación del producto.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acoustophorectic chamber</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-AC-K1 Cadence acoustic chamber kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ActiCHO P</td>
			<td>GE</td>
			<td>SH31025.01</td>
			<td>powder medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AWS</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-SYS (60500101-SP)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cadence Acoustic Separator Software</td>
			<td>Pall</td>
			<td>Cadence Acoustic Separator Interface Ver. 1.0.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1 cells</td>
			<td>VRC</td>
			<td>VRC01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Latitude 3470</td>
			<td>Windows 7, 64 bit OS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (70%)</td>
			<td>LabChem</td>
			<td>LC157605</td>
			<td>20L prepped 70% IPA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-CV</td>
			<td>200 mM stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S 14 tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>96400-14</td>
			<td>peroxide-cured silicone tubing, 25ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S 16 tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>96400-16</td>
			<td>peroxide-cured silicone tubing, 25ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing set</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-FP-K1 Tubing set</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbidity probe</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-TS-S1 (60500106)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary clarification of cho harvested cell culture fluid using an acoustic separator

La clarificación primaria es un paso esencial en un proceso de biofabricación para la eliminación inicial de células de productos terapéuticos dentro del fluido de cultivo celular cosechado. Si bien los métodos tradicionales como la centrifugación o la filtración se implementan ampliamente para la eliminación de células, el equipo para estos procesos tiene grandes huellas y la operación puede implicar riesgos de contaminación y ensuciamiento del filtro. Además, los métodos tradicionales pueden no ser ideales para esquemas de bioprocesamiento continuo para la clarificación primaria. Por lo tanto, se investigó una aplicación alternativa utilizando ondas acústicas (sonoras) para separar continuamente las células del fluido de cultivo celular. En este estudio se presenta un protocolo detallado para el uso de un separador de ondas acústicas (AWS) a escala de banco para la separación primaria del fluido de cultivo que contiene un anticuerpo IgG1 monoclonal de una cosecha de biorreactores de células CHO. Los datos representativos se presentan desde AWS y demuestran cómo lograr una aclaración de celdas y recuperación de productos efectivas. Por último, se analizan las posibles aplicaciones de AWS en el bioprocesamiento continuo. En general, este estudio proporciona un protocolo práctico y general para la implementación de AWS en la clarificación primaria para cultivos celulares CHO y describe con más detalle su potencial de aplicación en el bioprocesamiento continuo.

Como se describe en el protocolo, el AWS se utilizó para aclarar HCCF a una densidad de 12,4 x 106 celdas/ml, como se muestra en la Figura 1. La bomba de alimentación se ajustó a 3,5 ml / min (5 L / día), lo que representa una tasa de sangrado celular dentro del rango adecuado presumible para un cultivo de 10-20 L. A medida que el HCCF entró en la cámara AWS, las mediciones de turbidez de la sonda de turbidez de alimentación se mantuvieron consistentes, alrededor de 1.000-1.100 NTU, y las mediciones de la sonda de turbidez de la sonda de sonda1 se mantuvieron alrededor de 40-50 NTU(Figura 8). Usando las dos mediciones, la eficiencia de eliminación de células
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ02.jpg">
se calculó y promedió el 95%. Se encontró que una medición de turbidez de 40-50 NTU era el nivel mínimo de turbidez alcanzable y, por lo tanto, no era factible una mayor separación de una cámara DE AWS adicional en serie.
Si bien el AWS podría separarse con alta eficiencia a tasas de flujo más bajas, mantener el HCCF durante más tiempo dentro de la cámara causó aumentos de temperatura, lo que debe ser una consideración al seleccionar tasas de flujo más bajas. La Figura 9 es un ejemplo de la diferencia de temperatura del HCCF antes de entrar en la cámara acustoforética y después de la separación acústica a un caudal de alimentación de 3,5 mL/min, que mostró un aumento de temperatura de >6 °C debido al tiempo prolongado dentro de la cámara acústica.
Otra consideración importante al ejecutar cosechas de alta densidad celular (es decir, >20 x 106 células / ml) es la saturación de las sondas de turbidez. Las mediciones de turbidez para la sonda de turbidez de alimentación se saturaron en más de 4.400 NTU(Figura 10),lo que puede resultar en una subestimación en el cálculo de la eficiencia de eliminación celular.
Para probar el efecto de las diferentes velocidades de alimentación en la clarificación celular, se midió la eficiencia de eliminación de células a diferentes velocidades de alimentación. Como se muestra en la Figura 11,la eficiencia de eliminación de celdas disminuyó significativamente de ~ 100% a 57% a medida que aumentaba la velocidad de la bomba de alimentación. En general, cuanto más lenta sea la velocidad de la bomba de alimentación, mejor será la clarificación de la celda. Sin embargo, se recomienda la optimización de la velocidad de alimentación para cada aplicación.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig01.jpg"> Figura 1: Configuración de AWS. Una vez que las bombas se encendieron con el software(a ), el HCCF se canalizó a través de una bomba de alimentación (b) a través de la sonda de turbidez de alimentación (c) y luego a la cámara AWS (d). Dentro de la cámara, las fuerzas acústicas atraparon las células del flujo en los nodos de las ondas y causaron aglomeraciones. La disminución de la flotabilidad hizo que las células cayeran a través de la fuerza gravitacional, y las células se eliminaron del puerto de desechos de la cámara acustoforética a través de la bomba de etapa 1 (e) a una botella de cosecha celular (f) mientras que el material clarificado salió a la sonda de turbidez de la sonda(c)a través del puerto de permeado de la cámara a una botella de cosecha de producto (g). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig02.jpg"> Figura 2: Parte posterior del sistema AWS. Las sondas de turbidez y las cámaras están conectadas a sus respectivospuertos en la parte posterior del sistema AWS a través de cables Ethernet (a) y BNC(b)de alimentación de cámara. Además, la computadora está conectada a través del cable ethernet de la PC (c). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig03.jpg"> Figura 3: Sondas de turbidez y carcasa. Cada sonda de turbidez(a ) debe insertarse correctamente en el medidor de turbidez y la carcasa del termómetro respectivos (b) y apretarse con los tornillos. El cable BNC de alimentación de la cámara (c) debe conectarse a la parte posterior de la cámara acustoforética (d) solo después de que el transductor piezoeléctrico de la cámara se llene de líquido. Las sondas se indican de la siguiente manera: F = turbidez de alimentación, 1 = turbidez de la sonda 1, y 2, 3 y 4 son sondas no utilizadas (o se pueden usar para serializar el procedimiento). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig04.jpg"> Figura 4: Conexión entre la carcasa de turbidez y la cámara acustoforética. El tubo de alimentación está conectado a la entrada del puerto de turbidez dealimentación( a ) a través de la bomba de alimentación. La salida del puerto de turbidez de alimentación (b) se conecta a los puertos de entrada de la cámara acustoforética (c) a través de tubos en y. El tubo de la etapa 1 se conecta desde el puerto de desechos de la cámara acustoforética (d) a través de la bomba de la etapa 1 a un recipiente de recolección de celdas. El puerto de permeado de la cámara acustoforética (e) está conectado a la entrada del puerto de turbidez de la sonda1 (f). El tubo de cosecha está conectado desde fuera del puerto de turbidez de la sonda1 (g) a un recipiente de recolección de productos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig05.jpg"> Figura 5: Panel de lecturas en el software Del separador acústico. El programa cuenta con dos paneles, "Lecturas" y "Controles". Dentro del panel "Lecturas", se monitorean la turbidez(a ), la temperatura (b) y el porcentaje de reducción (c). Para iniciar la grabación de datos, se debe hacer clic en el botón "Iniciar prueba"(d),que cambiará el color del botón a verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig06.jpg"> Figura 6: Panel de controles en el programa. Dentro del panel "Controles", las bombas se pueden encender o apagar, y la velocidad de bombeo se puede cambiar para la alimentación (a) y otras etapas (b). Además, la alimentación de la cámara en el transductor piezoeléctrico se puede encender o apagar(c)y cambiarse con una barra deslizante(d). Los experimentos utilizaron 10 W, porque es el ajuste de potencia recomendado para las células CHO según lo recomendado por el fabricante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig07.jpg"> Figura 7: Cámara de AWS. Una vez que las células estaban dentro de la cámara, las fuerzas acústicas atrapaban las células en nodos de ondas y hacían que las células se agruparan (a). Estos grupos celulares aumentaron de tamaño hasta que perdieron su flotabilidad y finalmente se asentaron por la fuerza gravitacional (b). A continuación, las células asentadas se retiraron del puerto de desechos de la cámara acustoforética a través de la bomba de etapa 1 a una botella de cosecha de células (c). El producto salió de la cámara a través del puerto de permeado (d), mientras que HCCF llenó continuamente la cámara a través de los puertos de entrada (e). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig08.jpg"> Figura 8: Mediciones de turbidez para un cultivo celular CHO de 12 x10 6 celdas/ml con una velocidad de bomba de alimentación de 3,5 ml/min. La turbidez de alimentación (azul) fue de aproximadamente 1,000 NTU y el permeado que salió del medidor de turbidez de etapa 1 (naranja) fue de 40 a 60 NTU. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig09.jpg"> Figura 9: Mediciones de temperatura para un cultivo de células CHO de 12 x10 6 celdas/ml con una velocidad de bomba de alimentación de 3,5 ml/min. La temperatura de alimentación (azul) fue de aproximadamente 21 ° C y el permeado que salió del medidor de turbidez de la etapa 1 (naranja) fue de aproximadamente 27 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig09large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig10.jpg"> Figura 10: Ejemplo de medición de turbidez para una muestra de alta densidad celular. Cuando la densidad celular fue de >20 x 106 células/ml, la medición de la turbidez de alimentación se saturó al valor máximo de 4.400 NTU, lo que resultó en una subestimación de la eficiencia de eliminación celular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig10large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig11.jpg"> Figura 11: Comparación de la eficiencia de eliminación de células. A medida que aumentaba la velocidad de alimentación, la separación celular disminuía. Por lo tanto, a medida que aumentaba la velocidad de alimentación, la eficiencia de clarificación celular disminuía. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig11large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Parámetro</td>
			<td>Especificación</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gasto</td>
			<td>0 – 10 L/h</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rango de presión</td>
			<td>0 – 2 bar (0 – 30 psi)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temperatura del fluido de alimentación</td>
			<td>0 – 40 °C (32 – 104 °F)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temperatura de funcionamiento</td>
			<td>0 – 40 °C (32 – 104 °F)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Condiciones de funcionamiento. Las condiciones de funcionamiento recomendadas por el fabricante de AWS para el caudal, el rango de presión, el fluido de alimentación y la temperatura de funcionamiento.

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Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Aquí se presenta un protocolo para la clarificación primaria del cultivo celular CHO utilizando un separador acústico. Este protocolo se puede utilizar para la clarificación primaria de cultivos de matraz de agitación o cosechas de biorreactores y tiene la aplicación potencial para la clarificación continua del material de purga celular durante las operaciones de biorreactor de perfusión.

Clarificación primaria del fluido de cultivo celular cosechado con CHO utilizando un separador acústico

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

primary-clarification-cho-harvested-cell-culture-fluid-using-an

Research

JoVE Journal

Bioengineering

5.0K vistas.  U.S. Food and Drug Administration. Aquí se presenta un protocolo para la clarificación primaria del cultivo celular CHO utilizando un separador acústico. Este protocolo se puede utilizar para la clarificación primaria de cultivos de matraz de agitación o cosechas de biorreactores y tiene la aplicación potencial para la clarificación continua del material de purga celular durante las operaciones de biorreactor de perfusión.

Video: Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale's proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.
An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale's biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.
To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.
Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Development of custom assays on the ViBE platform for more sensitive, reproducible, automated results in complex matrices is described. The universal cartridge allows assays to be easily adapted for use with custom assays. This versatility enables rapid development and validation of novel assays or automated versions of existing manual assays, exemplified in this video.

Desarrollar ovario de hámster chino anfitrión-ensayos con células de proteínas utilizando la tecnología de membrana acústica de micropartículas

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Investigación

Bioingeniería

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level. However, this is not easily achieved because the small amount of labile mRNA present in a single cell (1-5% of 1-50pg total RNA, or 0.01-2.5pg mRNA, per cell 1) mostly degrades before it can be reverse transcribed into a stable cDNA copy. For example, using standard laboratory reagents and hardware, only a small number of genes can be qualitatively assessed per cell 2. One way to increase the efficiency of standard laboratory reverse transcriptase (RT) reactions (i.e. standard reagents in microliter volumes) comprising single-cell amounts of mRNA would be to more rapidly mix the reagents so the mRNA can be converted to cDNA before it degrades. However this is not trivial because at microliter scales liquid flow is laminar, i.e. currently available methods of mixing (i.e. shaking, vortexing and trituration) fail to produce sufficient chaotic motion to effectively mix reagents. To solve this problem, micro-scale mixing techniques have to be used 3,4. A number of microfluidic-based mixing technologies have been developed which successfully increase RT reaction yields 5-8. However, microfluidics technologies require specialized hardware that is relatively expensive and not yet widely available. A cheaper, more convenient solution is desirable. The main objective of this study is to demonstrate how application of a novel "micromixing" technique to standard laboratory RT reactions comprising single-cell quantities of mRNA significantly increases their cDNA yields. We find cDNA yields increase by approximately 10-100-fold, which enables: (1) greater numbers of genes to be analyzed per cell; (2) more quantitative analysis of gene expression; and (3) better detection of low-abundance genes in single cells. The micromixing is based on acoustic microstreaming 9-12, a phenomenon where sound waves propagating around a small obstacle create a mean flow near the obstacle. We have developed an acoustic microstreaming-based device ("micromixer") with a key simplification; acoustic microstreaming can be achieved at audio frequencies by ensuring the system has a liquid-air interface with a small radius of curvature 13. The meniscus of a microliter volume of solution in a tube provides an appropriately small radius of curvature. The use of audio frequencies means that the hardware can be inexpensive and versatile 13, and nucleic acids and other biochemical reagents are not damaged like they can be with standard laboratory sonicators.

We describe a novel method for increasing cDNA yield from single-cell quantities of mRNA in otherwise standard laboratory reverse transcription reactions. The novelty resides in the use of a micromixer, which utilizes the phenomenon of acoustic microstreaming, to mix fluids at microliter scales more effectively than shaking, vortexing or trituration.

Aumentar el rendimiento de cDNA a partir de una sola célula cantidades de ARNm en las reacciones de laboratorio estándar de la transcriptasa inversa con microcorrientes acústica

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling in the tumor microenvironment 1. Previously, research on the tumor microenvironment has focused primarily on tumor-stromal interactions 1-2. However, the tumor microenvironment also includes a variety of biophysical forces, whose effects remain poorly understood. These forces are biomechanical consequences of tumor growth that lead to changes in gene expression, cell division, differentiation and invasion3. Matrix density 4, stiffness 5-6, and structure 6-7, interstitial fluid pressure 8, and interstitial fluid flow 8 are all altered during cancer progression.
Interstitial fluid flow in particular is higher in tumors compared to normal tissues 8-10. The estimated interstitial fluid flow velocities were measured and found to be in the range of 0.1-3 &mu;m s-1, depending on tumor size and differentiation 9, 11. This is due to elevated interstitial fluid pressure caused by tumor-induced angiogenesis and increased vascular permeability 12. Interstitial fluid flow has been shown to increase invasion of cancer cells 13-14, vascular fibroblasts and smooth muscle cells 15. This invasion may be due to autologous chemotactic gradients created around cells in 3-D 16 or increased matrix metalloproteinase (MMP) expression 15, chemokine secretion and cell adhesion molecule expression 17. However, the mechanism by which cells sense fluid flow is not well understood. In addition to altering tumor cell behavior, interstitial fluid flow modulates the activity of other cells in the tumor microenvironment. It is associated with (a) driving differentiation of fibroblasts into tumor-promoting myofibroblasts 18, (b) transporting of antigens and other soluble factors to lymph nodes 19, and (c) modulating lymphatic endothelial cell morphogenesis 20.
The technique presented here imposes interstitial fluid flow on cells in vitro and quantifies its effects on invasion (Figure 1). This method has been published in multiple studies to measure the effects of fluid flow on stromal and cancer cell invasion 13-15, 17. By changing the matrix composition, cell type, and cell concentration, this method can be applied to other diseases and physiological systems to study the effects of interstitial flow on cellular processes such as invasion, differentiation, proliferation, and gene expression.

Interstitial fluid flow is elevated in solid tumors and can modulate tumor cell invasion. Here we describe a technique to apply interstitial fluid flow to cells embedded in a matrix and then measure its effects on cell invasion. This technique can be easily adapted to study other systems.

Tridimensional de la célula modelo de cultivo para medir los efectos del flujo del fluido intersticial en la invasión de células tumorales

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Co-cultivo celular Patterning Uso acuoso de dos fases Sistemas

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Flujo de microfluidos Cámaras utilizando sangre reconstituida a Modelo Hemostasia y Transfusión de Plaquetas<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing drugs targeted at the liver, requires a platform in which cells receive proper biochemical and mechanical cues. Recent liver tissue engineering systems have employed three-dimensional (3D) scaffolds composed of synthetic or natural hydrogels, given their high water retention and their ability to provide the mechanical stimuli needed by the cells. There has been growing interest in the inverted colloidal crystal (ICC) scaffold, a recent development, which allows high spatial organization, homotypic and heterotypic cell interaction, as well as cell-extracellular matrix (ECM) interaction. Herein, we describe a protocol to fabricate the ICC scaffold using poly (ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) and the particle leaching method. Briefly, a lattice is made from microsphere particles, after which a pre-polymer solution is added, properly polymerized, and the particles are then removed, or leached, using an organic solvent (e.g., tetrahydrofuran). The dissolution of the lattice results in a highly porous scaffold with controlled pore sizes and interconnectivities that allow media to reach cells more easily. This unique structure allows high surface area for the cells to adhere to as well as easy communication between pores, and the ability to coat the PEGDA ICC scaffold with proteins also shows a marked effect on cell performance. We analyze the morphology of the scaffold as well as the hepatocarcinoma cell (Huh-7.5) behavior in terms of viability and function to explore the effect of ICC structure and ECM coatings. Overall, this paper provides a detailed protocol of an emerging scaffold that has wide applications in tissue engineering, especially liver tissue engineering.

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.

La fabricación de cristal invertida coloidal poli (etilenglicol) Andamios: Una célula Plataforma de cultivo tridimensional para ingeniería de tejidos de hígado

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

Fabricación y validación de un sistema de órganos-en-viruta con electrodos integrados directamente cuantificar Transendothelial resistencia eléctrica

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process involves seeding of epithelial cells sparsely in a 3D matrix gel on a 96-well microplate with media changes to cultivate expansion into organoids. Morphology is then assessed by whole-well capturing of z-stack images. Compression of z-stacks creates a single in-focus image from which organoids are measured to quantify a variety of outputs, including circularity, roundness, and area.DNA, RNA, and protein can be collected from organoids recovered from the matrix gel. Cell populations of interest can be assessed by organoid dissociation and flow cytometry. Formalin-fixation-paraffin-embedding (FFPE) followed by sectioning is used for the histological assessment and antibody staining. Whole-mount immunofluorescent staining preserves organoid morphology and facilitates observation of protein localization in organoids in situ. Commercial assays that are traditionally used for 2D monolayer cells can be modified for 3D organoids. Used together, the techniques in this protocol provide a robust toolbox to quantify prostate organoid growth, morphologic characteristics, and expression of differentiation markers.

Here, we present a protocol to guide human primary prostate organoid handling then suggest endpoints to assess phenotype. Seeding, culture maintenance, recovery from matrix gel, morphologic quantification, embedding and sectioning, FFPE sectioning, whole-mount staining, and application of commercial assays are described.

Manejo y evaluación de la cultura humana organoide de próstata primario

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various biological activities including cell proliferation, survival, migration and differentiation. Several aberrations in the FGFR signaling pathway, owing to mutations or gene amplification events, have been identified in various types of cancers. Hence, recent research has focused on developing strategies involving therapeutic targeting of FGFRs. Current FGFR inhibitors at various stages of pre-clinical and clinical development include either small molecule inhibitors of tyrosine kinases or monoclonal antibodies, with only a few peptide- based inhibitors in the pipeline. Here, we provide a protocol using phage display technology to screen small peptides as antagonists of FGFR2. Briefly, a library of phage-displayed peptides was incubated in a plate coated with FGFR2. Subsequently, unbound phage was washed off by TBST (TBS + 0.1% [v/v] Tween-20), and bound phage was eluted with 0.2 M glycine-HCl buffer (pH 2.2). The eluted phage was further amplified and used as input for the next round of biopanning. Following three rounds of biopanning, the peptide sequences of individual phage clones were identified by DNA sequencing. Finally, the screened peptides were synthesized and analyzed for affinity and biological activity.

Herein, we present a detailed protocol for screening small peptides that bind to FGFR2 using a phage display peptide library. We further analyze the affinity of the selected peptides toward FGFR2 in vitro and its ability to suppress cell proliferation.

Detección e identificación de pequeños péptidos dirigidos al receptor de factor de crecimiento de fibroblastos2 utilizando una biblioteca de péptidos de pantalla de fago

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is an important structure of gingival tissue, especially in the repair and regeneration of periodontal tissue. Studying the functions of gingival epithelial cells has crucial scientific value, such as repairing oral defects and detecting the compatibility of biomaterials. As human gingival epithelial cells are highly differentiated keratinized cells, their lifespan is short, and they are difficult to passage. So far, there are only two ways to isolate and culture gingival epithelial cells, a direct explant method and an enzymatic method. However, the time required to obtain epithelial cells using the direct explant method is longer, and the cell survival rate of the enzymatic method is lower. Clinically, the acquisition of gingival tissue is limited, so a stable, efficient, and simple in vitro isolation and culture system is needed. We improved the traditional enzymatic method by adding Y-27632, a Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor, which can selectively promote the growth of epithelial cells. Our modified enzymatic method simplifies the steps of the traditional enzymatic method and increases the efficiency of culturing epithelial cells, which has significant advantages over the direct explant method and the enzymatic method.

Here we present a modified method for the isolation and culture of human gingival epithelial cells by adding the Rock inhibitor, Y-27632, to the traditional method. This method is easier, less time-consuming, enhances stem cell properties, and produces larger numbers of high-potential epithelial cells both for the laboratory and for clinical applications.

Aislamiento y cultivo de células epiteliales gingivales humanas primarias utilizando Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...