En comparación con otros métodos, este protocolo es más fácil de encontrar nuevos antagonistas, agonisteres y moduladores alotéricos cuantitativa y cualitativamente sin conocer la estructura hidro-dilución y la formación de la proteína diana. Este protocolo es altamente eficiente, fácil de manejar, económico y disponible comercialmente. Combinando este método de cribado de alto rendimiento con el análisis ITC, los pequeños péptidos funcionales se pueden obtener cuantitativa y cualitativamente.
Demostrando el procedimiento serán Ying Zhao y Qiang Wang, estudiantes graduados de nuestro laboratorio. Para comenzar este procedimiento, prepare una solución de FGFR2 en tampón de recubrimiento a una concentración de 10 microgramos por mililitro. Añadir un mililitro de la solución a un plato de 35 centímetros cuadrados y girar repetidamente hasta que la superficie esté completamente húmeda.
Incubar durante la noche a cuatro grados centígrados con temblores. Al día siguiente, vierta la solución de recubrimiento y agregue la solución de bloqueo preparada. Incubar a cuatro grados centígrados durante al menos una hora, luego desechar la solución de bloqueo y lavar rápidamente la placa seis veces con TBST mientras se asegura de que el plato no se seque.
Reconstituir la biblioteca de fagos original en un mililitro de TBST y añadir esto al plato recubierto. Mece suavemente el plato en una coctelera a temperatura ambiente durante dos horas. Después de esto, deseche el sobrenadante y lave el plato 10 veces con TBST.
Eluda el fago ligado añadiendo un mililitro de 0,2 molar glicina HCL al plato y balanceándose suavemente a temperatura ambiente durante 10 minutos. Transfiera el eluyente a un tubo de microcentrífuga esterilizado y neutralícelo con 100 microlitros de un Molar Tris-HCL a pH 9.1. En primer lugar, precalienta las placas PREPARADAs LB e IPTG X-Gal a 37 grados Celsius durante al menos una hora antes de su uso.
Usando puntas de pipeta con cartuchos de filtro, prepare 100 microlitros de diluciones diez veces del eluyente en LB. Después de que el cultivo de E.coli preparado alcance la fase de registro medio, dispensar 200 microlitros del cultivo en tubos de microcentrífuga esterilizado uno para cada dilución eluente. Para iniciar la infección, añadir 50 microlitros de cada dilución a los tubos que contienen el cultivo de E.coli. Vortex rápidamente e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.
A continuación, utilice varillas de recubrimiento para recubrir las placas LB e IPTG X-GAL con 90 microlitros de esta mezcla. Después de cinco minutos, invierta las placas e incubarlas durante la noche a 37 grados centígrados. Cuente las placas cuando aparezcan.
Para empezar, diluir el cultivo nocturno en 20 mililitros de LB en un matraz Erlenmeyer de 250 mililitros. Añadir el eluyente no amplificado e incubar a 37 grados Celsius con agitación vigorosa durante 4-1/2 horas. A continuación, centrifugar la cultura a 12.000 veces G y cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Centrifugar de nuevo utilizando las mismas condiciones y deseche el pellet. Transfiera el 80% superior del sobrenadante a un tubo fresco y agréguelo a 1/6o volumen de 20% polietilenglicol y 2,5 molar de cloruro sódico.
Deje que el fago se precipite durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, centrifugar el fago precipitado a 12.000 veces G y cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Deseche el sobrenadante y la centrífuga de nuevo utilizando las mismas condiciones.
Utilice una pipeta para eliminar el sobrenadante residual. Resuspender el pellet en un mililitro de TBS y transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga. Centrifugar a 12.000 veces G y cuatro grados centígrados durante cinco minutos.
Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco y precipite de nuevo añadiendo 1/6o volumen de 20% polietilenglicol y 2,5 molar de cloruro sódico. Incubar sobre hielo durante 15 a 60 minutos. A continuación, centrifugar a 12.000 veces G y cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
Deseche el sobrenadante y la centrífuga de nuevo utilizando las mismas condiciones. Utilice una pipeta para eliminar el sobrenadante residual. Resuspender el pellet en 200 microlitros de TBS y centrífuga durante un minuto adicional para eliminar las impurezas.
A continuación, transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco para obtener el eluyente amplificado. En este estudio, el número de aportes de fagos se mantiene sin cambios, mientras que la concentración de recubrimiento de la proteína FGFR2 se reduce gradualmente. Los resultados del título de fagos sugieren que el número de fagos recuperados aumenta gradualmente y que después de tres rondas, hay un aumento de 65 veces en comparación con el de la primera ronda.
A continuación, se lleva a cabo un experimento de ITC para medir la afinidad del péptido pequeño con FGFR2. Los resultados indican que el péptido SP1 tiene una alta afinidad hacia FGFR2. Estos datos demuestran la eficacia del protocolo de cribado.
Para investigar la actividad biológica del péptido SP1, se realiza un ensayo de proliferación de fibroblastos utilizando un kit CCK-8. BALB/C3T3 se incuban con el péptido SP1 a diferentes concentraciones. Los resultados sugieren que el péptido SP1 suprime el crecimiento de las células.
La contaminación por fagos de tipo salvaje tiene que evitarse aquí. Asegúrese de utilizar puntas de pipeta resistentes a aerosoles. Mientras que el crecimiento mediante la obtención de amplificación de fagos.
Este procedimiento también se puede utilizar en la detección de pequeños péptidos que se unen a los carbohidratos, células de cultivo y tejidos. Esos péptidos pueden ser más amplificados sobre el diagnóstico y
