Este trabajo fue apoyado por la Fundación Coulter, Fundación Beyster, la Oportunidad de Investigación de Pregrado (UROP) programa de verano para ATA y la National Science Foundation Graduate Student Research Fellowship (Grant no DGE 0718128, ID:. 2010101926) para JBW.

1. Fase de caracterización del sistema: Los umbrales determinantes para la separación de fases <ol><li> Preparar soluciones que contienen PEG y DEX en el tampón deseado o medio de cultivo celular como se muestra en la Figura 1 (puntos púrpura) en 15 ml o 50 tubos cónicos ml. En lo sucesivo, PEG y DEX se refieren a PEG de 35 kDa y 500 kDa DEX, sin embargo, concentraciones críticas cambiará en función de los dos polímeros utilizados. Registrar la masa de PEG y DEX en cada solución. Alta concentración de las soluciones de polímero puede tardar varias horas para disolver. Vórtice puede ser utilizado para soluciones libres de suero. Para medios que contienen proteínas o de suero, se colocan los tubos en una etapa balanceo hasta que los dos polímeros se disuelven completamente. Anotar el peso de los medios utilizados para disolver los polímeros y tomar nota de las concentraciones iniciales. </li><li> Una vez que los polímeros se disuelven completamente, las soluciones deben aparecer turbia. Esta es la primera indicación de que la separación de fases se ha producido. Para confirmar esto, permitir que elsoluciones de polímero a descansar en una posición vertical a temperatura ambiente durante 20 min. La centrifugación a 1.000 xg se puede usar para acelerar el proceso de separación de fases. La fase inferior densa será DEX-rica y la fase superior será PEG-rico. </li><li> Lentamente añadir tampón adicional o medios de comunicación a los tubos. Pequeños incrementos deben utilizarse a fin de no sobrepasar el punto de separación de fases. </li><li> Cuando la solución se vuelva clara y ya no se separa de fase después de la centrifugación, el umbral para la separación de fases se ha alcanzado. Registrar el peso final del tubo. </li><li> Utilizando los pesos anteriores registrados para los polímeros, junto con el peso final tras la adición de medios, determinar el% en peso / peso de cada uno de los dos polímeros en el que la separación de fases ya no se produce. </li><li> Trazar estos valores en% en peso / peso de PEG en el eje y, y% peso / peso de DEX en el eje x. Esta trama, conocida como la curva binodal, se puede utilizar para determinar el umbral de concentración para la separación de fases para diferentes concentratiComplementos de PEG / DEX en un medio de cultivo celular específica. </li></ol> 2. Configuración 1: Exclusión Patrones (96-así formato de placa) <ol><li> Preparar soluciones separadas de 5,0% peso / peso de PEG y 12,8% DEX peso / peso en medio de cultivo celular. Utilizar soluciones ATPS de al menos dos veces el punto crítico para garantizar que un ATPS permanece después de los polímeros equilibrar con respecto a la otra. Hay una pequeña cantidad de flujo de DEX en la fase de PEG-rico y viceversa, por lo tanto, trabajando demasiado cerca de la concentración crítica puede resultar en la pérdida del sistema de fase como la caída de las concentraciones por debajo del punto crítico. De manera similar, la transferencia de la placa de cultivo celular a una incubadora con humedad y temperatura controladas pueden alterar las propiedades de dos fases y hacer que las dos soluciones miscibles. Nota: Algunas células pueden funcionar mejor con otras formulaciones ATPS. Formulaciones aceptables pueden ser seleccionados en base a las curvas de binodal determinados a partir de la Parte 1. </li><li> Recoger las células que se utilizarán para la exclusión patteRT ENCIA. Determinar el número total / concentración de células disponibles. Opcional: marcar las células con CellTracker u otros no citotóxicos etiquetas para microscopía de fluorescencia. </li><li> Sedimentar las células y resuspender el sedimento en un volumen apropiado de 5,0% de PEG para lograr el número deseado de células por exclusión. Por ejemplo, un pocillo de una placa de 96 pocillos requiere 37.500 células de fibroblasto que se resuspendió en 200 l de PEG para producir confluencia el día siguiente. Escala estos números según sea apropiado para otros tipos de células y tamaños de sustrato de cultivo. </li><li> Usando una micropipeta, dispensar gotas 0,5 l de DEX sobre un sustrato de cultivo celular seco. Las gotas más grandes producen mayores volúmenes de zonas de exclusión. Las gotitas que varían en tamaño desde 0,1 hasta 1 l se recomiendan para micropatterning exclusión. Opcional: DEX gotitas pueden depositarse 24 hr antes de tiempo y se dejó deshidratar a temperatura ambiente. Esto puede producir patrones más limpios. </li><li> Dispensar 200 l de suspensión celular en t PEGasí que para cubrir las gotas DEX. </li><li> Colocar en un humidificado incubadora durante 12 horas a 37 ° C, 5% de CO 2. Asegúrese de que el plato no está inclinado durante la manipulación y que se coloca en un nivel de estantería incubadora para evitar la interrupción de los patrones. </li><li> Quitar la solución de PEG y se lava tres veces con 200 l de medio de cultivo. </li><li> Añadir medio de cultivo fresco y el retorno a la incubadora. </li><li> Monitorear las culturas periódicamente para observar el movimiento celular en la zona de exclusión. </li></ol> 3. Configuración 2: La isla Patrones (96-así formato de placa) <ol><li> Se preparan soluciones de 5,0% en peso / peso de PEG y 12,8% DEX peso / peso en medio de cultivo celular, como anteriormente. </li><li> Recoger las células para ser utilizadas para modelar isla. Determinar el número total / concentración de células disponibles. </li><li> Pellets y resuspender las células en un volumen apropiado de DEX 12,8% para alcanzar la concentración deseada de células para el patrón isla. Las concentraciones de 5.000 ceLLS / l o menos se recomienda para tipos de células fuertemente adherentes. Para las células que tienen dificultad para montar o células que se adhieren débilmente, concentraciones de hasta 10.000 células / l puede ser considerado. </li><li> Trabajando con rapidez para evitar el secado, las gotitas de pipeta 0,5 l de DEX sobre un sustrato de cultivo celular seco, como se describió anteriormente. No permitir que las gotas a secar. Opcional: 200 l de solución de PEG se puede añadir a la bien delante de tiempo. Gotitas DEX entonces puede ser depositado en la solución de PEG donde se hunden hasta el fondo y en contacto con la superficie de cultivo. Esto puede producir patrones más limpios de la isla. </li><li> Cubra las gotas de DEX con 200 l de PEG. </li><li> Colocar en un humidificado incubadora durante 12 horas a 37 ° C, 5% de CO 2. Asegúrese de que el plato no está inclinado durante la manipulación y que se coloca en un nivel de estantería incubadora para evitar la interrupción de los patrones. </li><li> Quitar la solución de PEG y se lava tres veces con 200 l de medio de cultivo. </li><li> Añadir cultivo frescomedio y retorno a la incubadora. </li><li> Monitorear las culturas periódicamente para observar el movimiento celular y proliferación hacia el exterior de las islas. </li></ol> 4. Configuración 3: Exclusión Co-culturas (96-así formato de placa) <ol><li> Se preparan soluciones de 5,0% en peso / peso de PEG y 12,8% DEX peso / peso en medio de cultivo celular, como anteriormente. </li><li> Recoger las células que se utilizarán para la exclusión y el patrón isla. Determinar el número total / concentración de células disponibles para cada tipo de célula. Opcional: Algunas parejas celulares pueden mostrar índices de proliferación dramáticamente diferentes. Para evitar que las células excluidos de sobrepoblación de las células insulares patrón (especialmente para cultivos a largo plazo), el tratamiento de las células usadas para la exclusión con mitomicina C durante 2 horas o irradiar ellos antes de la cosecha. Esto evitará la proliferación. Los tintes fluorescentes CellTracker se puede utilizar para distinguir las dos poblaciones de células si es necesario. </li><li> Pellet las células y resuspender el pellet de exclusion patrones en un volumen apropiado de 5,0% de PEG para lograr el número deseado de células, como anteriormente. Resuspender el precipitado para modelar isla en un volumen apropiado de 12,8% DEX para conseguir la concentración deseada de células, como anteriormente. </li><li> Usando una micropipeta, dispensar gotas 0,5 l de suspensión celular DEX sobre un sustrato de cultivo celular seco. No permitir que las gotas a secar. </li><li> Cubrir las gotitas de DEX con 200 l de suspensión celular PEG. </li><li> Colocar en un humidificado incubadora durante 12 horas a 37 ° C, 5% de CO 2. Asegúrese de que el plato no está inclinado durante la manipulación y que se coloca en un nivel de estantería incubadora para evitar la interrupción de los patrones. </li><li> Quitar la solución de PEG y se lava tres veces en 200 l de medio de cultivo. </li><li> Añadir medio de cultivo fresco y el retorno a la incubadora. </li><li> Monitorear los co-cultivos de observar la interacción entre poblaciones de células. Opcional: Los controles pueden ser preparados mediante la realización de exclusión o isla patrón individually, por las células de co-cultivo que no interactúan o bloqueando las rutas de interés en una o ambas poblaciones de células antes o después de los patrones. </li></ol>

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Los autores no tienen intereses financieros en competencia.

La célula ATPS micropatterning método requiere conocimientos muy poco más allá de la competencia en técnicas de cultivo celular y se puede dominar rápidamente. Las ventajas de este enfoque son que es barato, rápido y compatible con una variedad de tipos de células y formatos de cultivo. Por estas razones, el protocolo debe ser fácilmente adoptada por científicos de la vida, en particular los que estudian la proliferación celular, la migración y la quimiotaxis, y la influencia de las interacciones yuxtacrina ...

Acuosos sistemas de dos fases (ATPSs) forma cuando las soluciones de dos polímeros incompatibles se mezclan juntos en concentraciones suficientemente altas. La separación de fases está influenciada por una variedad de factores que incluyen el peso molecular y la polaridad de los polímeros, la temperatura de las soluciones, pH y contenido iónico del disolvente acuoso 1, 2. El punto en el que las dos soluciones de polímeros separados se determina por las propiedades fisicoquímicas de la fase del sistema elegido, pero en general se produce a bajas concentraciones de polímero (menos de 20% peso / peso) bajo condiciones no desnaturalizantes, permitiendo ATPSs que se utilizará para la biotecnología 3-9 aplicaciones. Con mucho, los más ampliamente estudiados ATPS es el polietilenglicol (PEG) / sistema de dextrano (DEX). Los ATPS formadas por estos polímeros de bajo costo y biocompatible fue originalmente descrita para la purificación de biomoléculas por medio de partición molecular 2, 10. Particionamientose produce cuando las moléculas o partículas adicionales que no contribuyen al sistema de fase se mezclan con PEG y DEX. En base a sus afinidades relativas para ya sea DEX o PEG, las moléculas o partículas preferentemente residirá dentro de una de las dos fases o en el interfaz. Otra característica de la ATPS PEG / dex es la existencia de la tensión interfacial entre las dos fases de polímero. ATPSs formados por PEG y DEX generalmente muestran tensiones interfaciales que son mucho más bajos que otros líquido-líquido en sistemas de dos fases, tales como aceite y agua, sin embargo, las fuerzas de tensión interfacial todavía ejercen efectos sobre las pequeñas partículas tales como virus, células y agregados de proteínas 2 , 11-13. Finalmente, puesto que mayor peso molecular de PEG y DEX separado a bajas concentraciones (menos de 5% peso / peso de polímeros de alto peso molecular variedades) en presencia de concentraciones fisiológicas de sales, hay pocos o ningún efectos deletéreos sobre células de mamífero incorporado dentro de estos sistemas14-16. Recientemente, las propiedades interfaciales y los efectos de partición de ATPSs han sido aplicadas por nuestro laboratorio para el patrón celular 14, 16-20. Esto se logró por micropatterning una solución más densa DEX sobre sustratos de cultivo de células en presencia de PEG. Cuando las células se incorporan en la fase de PEG, se excluyen la entrada de las gotitas de DEX debido a PEG / dex tensión interfacial 20. Cuando las células se modelan en la fase de DEX, que son retenidos en la superficie del sustrato de cultivo celular mediante la tensión interfacial y la partición 16, 17, 19. En contraste con otros métodos para el patrón celular, patrón ATPS celular es fácil de aprender y sólo requiere conocimientos rudimentarios sobre los propios polímeros, y la capacidad para llevar a cabo el cultivo de células y el uso de una micropipeta. Otros métodos para modelar celular implican a menudo el equipo especializado y capacitación que no se traducen fácilmente a the las ciencias biológicas. Por ejemplo, algunos métodos (impresión por microcontacto de impresión de inyección de tinta o) células de patrón indirectamente mediante la aplicación de patrones de biomoléculas adhesivas celulares a un sustrato de cultivo que posteriormente sirven como sitios para la unión celular 21, 22. Aunque los enfoques indirectos son útiles para algunos tipos celulares, que requieren un alto grado de habilidad del usuario y equipo especializado para la fabricación de la herramienta de modelado, y puede carecer de especificidad dependiendo del tipo particular de células / biomolécula patrón. Alternativamente, las células pueden ser depositados con una especificidad alta patrón por medio de enfoques de modelado directos que incluyen patrones de flujo laminar, estarcir y la impresión de inyección de tinta 23-26. Sin embargo, estas técnicas también requieren experiencia del usuario y equipo especializado, y puede dañar las células durante el proceso de impresión. Si bien estos métodos generalmente producen patrones precisos de células, que permiten definir motivos de células a ser una herramienta útil en las ciencias de la vida, debe ser rentable unnd simple de implementar. Aquí mostramos un protocolo detallado para la generación de patrones de cultivos celulares utilizando los ATPSs descritos en nuestras aplicaciones previamente publicados. Usando sólo Micropipetas, los usuarios pueden generar zonas de células de exclusión o islas celulares para los ensayos de migración. Esto se consigue por medio de PEG / dex tensión interfacial que o bien conserva las células en la fase de DEX o excluye las células depositadas en la fase de PEG de DEX. Por el peinado de estas dos técnicas fundamentales de dibujo, es posible generar rápidamente co-cultivos de células tales como células de hígado de fibroblastos co-cultivos. Métodos de patterning, parámetros ATPS y los resultados esperados se describen en detalle.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Fabricante </td></tr><tr><td> 500.000 kDa dextrano </td><td> Pharmacosmos, Dinamarca </td></tr><tr><td> Polietilenglicol 35.000 kDa </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td></tr><tr><td> Hela </td><td> ATCC, Manassas, VA </td></tr><tr><td> HepG2 C3A </td><td> ATCC, Manassas, VA </td></tr><tr><td> NIH 3T3 </td><td> ATCC, Manassas, VA </td></tr><tr><td> Cell Tracker </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> F12 </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> Suero Bovino Fetal </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr></tbody></table>

cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems

Tecnologías de células de patrones que son rápidos, fáciles de usar y asequible se requiere para el desarrollo futuro de los ensayos de rendimiento de alta celulares, plataformas para el estudio de interacciones célula-célula y sistemas de ingeniería tisular. Este protocolo detallado se describe un método para la generación de co-cultivos de células utilizando soluciones biocompatibles de dextrano (DEX) y polietilenglicol (PEG) que los de fase separada cuando se combina encima de las concentraciones umbral. Las células se pueden modelar en una variedad de configuraciones que utilizan este método. Patrón célula exclusión se puede realizar mediante la impresión de gotitas de DEX sobre un sustrato y cubriéndolos con una solución de PEG que contienen células. La tensión interfacial formada entre la dos soluciones de polímero hace que las células estén en torno al exterior de la gotita de DEX y formar un claro circular que puede ser utilizado para los ensayos de migración. Islas de células puede ser modelado por dispensación de una fase rica en células DEX en una solución de PEG, o cubriendo la DEXgota con una solución de PEG. Co-cultivos se pueden formar directamente mediante la combinación de exclusión celular con DEX patrón isla. Estos métodos son compatibles con una variedad de enfoques de manejo de líquidos, incluyendo micropipeteo manual, y se puede usar con prácticamente cualquier tipo de célula adherente.

Para seleccionar una combinación apropiada de PEG y DEX para el patrón de células es importante para determinar la curva binodal. Esta curva delimita los puntos en los que un ATPS pueden formar y pueden variar para un conjunto dado de polímeros basada en la temperatura, pH y contenido iónico. Para el cultivo de células que requieren formulaciones personalizadas medio puede ser necesario para determinar experimentalmente la curva binodal. Esto se logra mediante la generación de una serie de ATPSs que están lejos ...

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Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Acuosos sistemas de dos fases se utiliza para poblaciones modelo simultáneamente múltiples de células. Este método rápido y fácil para el patrón celular se aprovecha de la separación de fases de las soluciones acuosas de glicol de polietileno y dextrano y la tensión interfacial que existe entre las dos soluciones de polímero.

Co-cultivo celular Patterning Uso acuoso de dos fases Sistemas

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.3K vistas.  University of Michigan. Acuosos sistemas de dos fases se utiliza para poblaciones modelo simultáneamente múltiples de células. Este método rápido y fácil para el patrón celular se aprovecha de la separación de fases de las soluciones acuosas de glicol de polietileno y dextrano y la tensión interfacial que existe entre las dos soluciones de polímero.

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Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

La litografía de plasma superficial Patrones de Creación de redes de telefonía

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Investigación

Bioingeniería

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

La visualización de la corteza organización y dinámica de los microorganismos, con total Microscopía de fluorescencia de reflexión interna

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

Un juego de herramientas para la conversión de hidrocarburos en ambientes acuosos

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Patrones celular en fotolitográficamente Definido Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Sustratos

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Producción Robótica de Cancer Cell esferoides con un sistema acuoso de dos fases para la prueba de la droga

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

El uso de adhesivo Patrones para construir dispositivos de microfluidos de papel 3D

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

Las construcciones en capas de alginato: Una plataforma para el co-cultivo de poblaciones celulares heterogéneas

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

Patrones sustractiva rápida de las capas de células vivas con una sonda de microfluidos

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells of the same or different type, micropatterning techniques have proved useful. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) is a micropatterning technique that targets the adhesion of cells to a substrate or other cells using DNA hybridization. The most basic operations in DPAC begin with decorating cell membranes with lipid-modified oligonucleotides, then flowing them over a substrate that has been patterned with complementary DNA sequences. Cells adhere selectively to the substrate only where they find a complementary DNA sequence. Non-adherent cells are washed away, revealing a pattern of adherent cells. Additional operations include further rounds of cell-substrate or cell-cell adhesion, as well as transferring the patterns formed by DPAC to an embedding hydrogel for long-term culture. Previously, methods for patterning oligonucleotides on surfaces and decorating cells with DNA sequences required specialized equipment and custom DNA synthesis, respectively. We report an updated version of the protocol, utilizing an inexpensive benchtop photolithography setup and commercially available cholesterol modified oligonucleotides (CMOs) deployed using a modular format. CMO-labeled cells adhere with high efficiency to DNA-patterned substrates. This approach can be used to pattern multiple cell types at once with high precision and to create arrays of microtissues embedded within an extracellular matrix. Advantages of this method include its high resolution, ability to embed cells into a three-dimensional microenvironment without disrupting the micropattern, and flexibility in patterning any cell type.

Here we present a protocol to micropattern cells at single-cell resolution using DNA-programmed adhesion. This protocol uses a benchtop photolithography platform to create patterns of DNA oligonucleotides on a glass slide and then labels cell membranes with commercially available complementary oligonucleotides. Hybridization of the oligos results in programmed cell adhesion.

Patrones simples, asequibles y modulares de células utilizando ADN

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat soft substrates that deform under cell traction (2D-TFM). TFM relies on the use of linear elastic materials, such as polydimethylsiloxane (PDMS) or polyacrylamide (PA). For 2D-TFM on PA, the difficulty in achieving high throughput results mainly from the large variability of cell shapes and tractions, calling for standardization. We present a protocol to rapidly and efficiently fabricate micropatterned PA hydrogels for 2D-TFM studies. The micropatterns are first created by maskless photolithography using near-UV light where extracellular matrix proteins bind only to the micropatterned regions, while the rest of the surface remains non-adhesive for cells. The micropatterning of extracellular matrix proteins is due to the presence of active aldehyde groups, resulting in adhesive regions of different shapes to accommodate either single cells or groups of cells. For TFM measurements, we use PA hydrogels of different elasticity by varying the amounts of acrylamide and bis-acrylamide and tracking the displacement of embedded fluorescent beads to reconstruct cell traction fields with regularized Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
To further achieve precise recording of cell forces, we describe the use of a controlled dose of patterned light to release cell tractions in defined regions for single cells or groups of cells. We call this method local UV illumination traction force microscopy (LUVI-TFM). With enzymatic treatment, all cells are detached from the sample simultaneously, whereas with LUVI-TFM traction forces of cells in different regions of the sample can be recorded in sequence. We demonstrate the applicability of this protocol (i) to study cell traction forces as a function of controlled adhesion to the substrate, and (ii) to achieve a greater number of experimental observations from the same sample.

Near-UV lithography and traction force microscopy are combined to measure cellular forces on micropatterned hydrogels. The targeted light-induced release of single cells enables a high number of measurements on the same sample.

Control de la adhesión celular mediante técnicas de patrón de hidrogel para aplicaciones en microscopía de fuerza de tracción

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...