Los organoides de próstata son un sistema in vitro emocionante para estudiar el desarrollo y la enfermedad. Superan los desafíos de las líneas celulares inmortalizadas y ofrecen una alternativa económica a los modelos animales. Pueden cultivarse a partir de células de próstata humanas, como hemos demostrado en este protocolo, así como de células de próstata de ratón, como un sistema modelo preclínica relevante para la enfermedad.
Muchos laboratorios han descrito métodos de referencia cultural y puntos de conexión útiles. Pero esperamos reunir esos detalles en un solo protocolo y demostrar los pasos particularmente desafiantes para los nuevos usuarios. A medida que las técnicas mejoran, los organoides del cáncer de próstata se pueden cultivar a partir de muestras de pacientes como un enfoque de medicina de precisión para la enfermedad modelo y la respuesta a las terapias.
Las condiciones de cultivo son específicas de los organoides de próstata, sin embargo muchos de los puntos finales se han adaptado de otros tipos de tejido. Un usuario podría adaptar partes de este protocolo a su tipo de celda de interés. Comience este experimento mediante el crecimiento de células epiteliales en placas de 96 pozos codificadas en gel de matriz como se describe en el manuscrito.
Para recoger organoides de las placas después de 12 días, retire el medio de los pozos sin alterar el gel de matriz. A continuación, añadir inmediatamente aproximadamente 200 microlitros de proteasa neutra a cada pozo en aproximadamente una relación de uno a dos de gel de matriz a proteasa neutra. Incubar la placa durante 20 minutos a 37 grados centígrados.
A continuación, pipetear hacia arriba y hacia abajo para disociar mecánicamente la mezcla, e incubar de nuevo durante 20 minutos a 37 grados centígrados. Después de la incubación, transfiera la mezcla de gel-célula de matriz de proteasa neutra de unos pocos pozos a un tubo de microcentrífuga. Pele las células por centrifugación a 300 veces g durante tres a cinco minutos.
Retire el sobrenadante y guarde el pellet organoide para análisis posteriores. Para crear moldes para incrustar, corte una pequeña sección de una punta de pipeta de 1.000 microlitros para hacer un cilindro que contenga 50 microlitros. A continuación, desde la parte más ancha de la misma punta, hacer un segundo molde más ancho que se ajusta alrededor del primer molde.
Para crear un bloque frío, envuelva una bolsa de hielo con cinta adhesiva con el lado adhesivo hacia arriba. A continuación, adhiera los moldes perpendicularmente a la cinta. Para incrustar los organoides en un tapón de gel histológico para su procesamiento, primero lave el pellet organoide previamente obtenido con un mililitro de la solución de sal equilibrada de Hank.
Después de centrifugar a 300 veces g durante tres a cinco minutos, retire el sobrenadante. A continuación, agregue de 30 a 50 microlitros de gel de histología líquida al pellet organoide, y mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo para resuspender el pellet. Transfiera esta mezcla a un molde en el bloque frío, y deje que la muestra se enfríe y se solidifique en un tapón.
A continuación, utilice un émbolo para empujar el enchufe fuera del molde pequeño y en el centro del molde más grande, y llénelo pipeteando claro 2%agar alrededor del enchufe. Para marcar la parte superior de la muestra, pipetee el 2% de agar teñido con tinte histológico en la parte superior del tapón. Una vez que el agar se haya enfriado, utilice un émbolo para transferir el enchufe a un casete histológico.
Etiquete el cassette con un lápiz y colóquelo en una formalina tamponada 10% neutra para una fijación durante la noche. Al día siguiente, transfiera el casete de formalina tamponada 10% neutral a etanol de grado histológico al 70%, y proceselo más e instálelo en parafina. Comience recortando la base del bloque con un grosor de 10 micrómetros.
Una vez que aparezca una sección que contenga el área del enchufe, deje de recortar. Bloquee el rotor del microtomo y transfiera el bloque de nuevo al hielo para enfriar. Mueva la hoja a una porción nueva y no utilizada.
Y transfiera el bloque de vuelta a la abrazadera. Desbloquee la máquina y comience a recortar a cinco micrómetros por sección. Use pinzas para transferir la sección al baño de agua Celsius de 40 grados, y permita que se extienda.
Sumerja un tobogán verticalmente en el agua para transferir la sección a ella. A continuación, observe la diapositiva bajo un microscopio de campo brillante para asegurarse de que un organoide está presente en la sección. Hornee durante la noche a 45 a 50 grados centígrados, y luego proceda con la tinción como se describe en el manuscrito.
Comience esta parte del experimento con pozos no utilizados de la placa recubierta de gel de matriz de 96 pozos con organoides. Al pipetear contra el lado del pozo, dejando espacio entre los medios y el gel de matriz, retire cuidadosamente tantos medios como sea posible sin interrumpir el cultivo organoide. Utilice una punta de pipeta recortada de 1.000 microlitros, pre-mojada con PBS para extraer una gota de gel de matriz que contenga los organoides de interés.
Dispensar la caída en el centro de un portaobjetos de la cámara. A simple vista, aspira el exceso de medios y el gel de matriz de la diapositiva de la cámara con una pipeta de punta fina. Promover la adherencia organoide al vidrio y evitar la pérdida de muestras durante los siguientes pasos de lavado.
Coloque el portaobjetos en una incubadora de 37 grados centígrados durante 30 a 45 minutos. Pipeteando lentamente para evitar el desprendimiento del plato, agregue 200 microlitros de 1X PBS para lavar los organoides durante cinco minutos a temperatura ambiente con un suave temblor. Retire cuidadosamente el 1X PBS y agregue 200 microlitros de 4%paraformaldehído.
Fijar durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. En PFA, lave y proceda con los siguientes pasos de permeabilización y tinción según lo descrito por este protocolo. Monte e imagen inmediatamente.
La diapositiva recién cortada sin mancha muestra claramente los organoides primarios de próstata humanos, mientras que en la diapositiva seca sin mancha, los organoides parecen translúcidos y son más difíciles de detectar bajo un microscopio de campo brillante. La tinción de hematoxilina y eosina muestra un organoide de próstata primario humano roto por un mal manejo, como pipeteo agresivo, protocolo de procesamiento incorrecto en comparación con un organoide bien manejado. El organoide prostático primario humano estaba fijado en formalina, incrustado en parafina, seccionado y teñido con citoqueratina basal 5 y citoqueratina luminal 8, p63 basal y citoqueratina luminal 8, e imágenes con microscopio confocal.
Un organoide prostático primario humano de montaje completo se tiñó con citoqueratina basal 5 o citoqueratina luminal 8, y se contratuvieron con faloideina y DAPI, y se obtuvo una imagen con microscopio confocal. Un organoide de células prostáticas primarias de próstata de montaje completo fue manchado con Edu con etiqueta fluorescente y contrarrestado con Hoescht, e imágenes con microscopio confocal. Es importante visualizar los organoides a lo largo del procedimiento.
Después de recoger las secciones, asegúrese de visualizar las muestras en la diapositiva y asegúrese de observar organoides durante el montaje completo. Después de recoger los organoides del gel de matriz, puede montarlos a todo el tamaño y utilizar ensayos comerciales, o disociar a células individuales para la citometría de flujo o secuenciación de una sola célula. El cultivo 3D proporciona a los investigadores una forma novedosa de estudiar el tejido en el entorno de un plato de laboratorio.
Se puede aplicar a la organogénesis, o a la comprensión de la patología de la enfermedad de un paciente. Cuando trabaje con muestras de pacientes, tenga siempre cuidado y maneje los materiales como potencial para la exposición de patógenos transmitidos por la sangre.
