La tasa de síntesis de proteínas se perturba durante la enfermedad y el envejecimiento. La recuperación de la fluorescencia después del fotoblanqueo, o FRAP, permite la medición de la tasa de síntesis de proteínas in vivo. Utilizamos gusanos C.elegans transparentes, que expresan GFP, como modelo para monitorear la síntesis de proteínas novedosa después de la fotoblanquida.
Proporcionamos directrices prácticas para medir la recuperación de la fluorescencia mediante el uso de gusanos transgénicos, que expresan la GFP bajo diferentes promotores, ya sea ampliamente expresados o en células o tejidos específicos. Además, este método ofrece monitoreo de la velocidad de síntesis de proteínas en tiempo real. Utilice un estereomicroscopio diseccionado para evaluar las etapas del desarrollo y el crecimiento de nematodos transgénicos de tipo salvaje y mutantes.
Escoge 10 larvas L4 de animales transgénicos salvajes y mutantes que lleven al reportero fluorescente deseado sobre placas de medios de crecimiento de nematodos sembradas con E.coli. Incubar y cultivar los nematodos a la temperatura estándar de 20 grados centígrados. Cuatro días más tarde, la placa contiene una población mixta de gusanos transgénicos.
Seleccione y transfiera 15 larvas L4 de cada cepa en placas OP50 NGM recién sembradas. Realice el ensayo FRAP y monitorice la tasa de síntesis de proteínas en el primer día de la edad adulta. Al día siguiente, preparar y utilizar placas NGM que contienen cicloheximida como un control positivo.
Elimine las bacterias exponiendo las placas NGM de semillas durante 15 minutos con luz UV. Añadir cicloheximida en la parte superior de placas de semillas bacterianas también 500 microgramos por ml de concentración final en el volumen de agar. Deje que las placas se sequen.
Transfiera nematodos transgénicos que expresen GFP en placas que contengan cicloheximida. Incubar animales durante dos horas a una temperatura estándar de 20 grados centígrados. Escoja y transfiera animales transgénicos adultos de un día a placas NGM individuales sembradas con una caída de 20 microlitros OP50 en el centro.
Retire la tapa y coloque cada placa debajo de una lente objetivo 20H de un microscopio epifluorescente. Enfoque y capture una imagen de referencia antes de photoblación. Fotoblecir cada muestra durante 10 minutos.
Capturar una imagen después de la fotoblancada. Mantenga a los animales en placas NGM individuales y déjelos recuperarse. Imagen y registro de la recuperación de cada reportero fluorescente cada una hora durante al menos seis horas a un estereomicroscopio epifluorescente.
Prepara almohadillas de 2% de agarosa y añade 10 microlitros de tampón M9 en el centro de la almohadilla de agarosa. Transfiera cinco nematodos transgénicos que expresen GFP citoplasmático pan-neuronal a una gota de tampón M9. Use una pestaña para esparcir el líquido.
Los animales muestran movimientos reducidos en dos minutos debido a la absorción de M9 en el agar. Cambie la posición del nematodo mediante un pico de pestañas. Coloque la muestra en la lente objetivo 40H de un microscopio epifluorescente sin usar un resbalón de cubierta.
Enfoque y capture una imagen de referencia. Fotoblecir un área de interés objetivo durante 90 segundos. Capturar una imagen después de la fotoblancada.
Agregue una gota de 10 microlitros de tampón M9 en nematodos fotoblanes. Deja que los animales se recuperen durante cinco minutos. Utilice el pico de pestañas o una pipeta para transferir los nematodos a placas NGM individuales sembradas con 20 microlitros OP50 gota en el centro.
Capture una imagen de cada muestra cada una hora bajo un estereomicroscopio epifluorescente. Los gusanos mutantes de tipo salvaje y fe-2 que expresan GFP citoplasmáticos a través de sus tejidos somáticos mediante el uso del promotor fe-2 fueron comparados antes, inmediatamente después del fotoblanqueo, y cinco horas después de la recuperación. Los animales de tipo salvaje se recuperaron por completo, mientras que los mutantes fe-2 tenían la capacidad de recuperación de minis.
Por lo tanto, los gusanos de tipo salvaje inician la síntesis normal de proteínas después de la fotoblanqueo, mientras que los gusanos que carecen del factor de iniciación de la traducción de ARNm fe-2 no pueden hacerlo, lo que indica que la tasa de recuperación fluorescente ilustra la tasa de síntesis de proteínas in vivo. Cicloheximida, un inhibidor específico de la traducción de ARNm se puede utilizar como un control positivo para la inhibición de la traducción de proteínas. De hecho, los animales transgénicos tratados con cicloheximida que expresan GFP citoplasmático bajo el promotor no recuperan su fluorescencia al fotoblancarse.
Los cuerpos de procesamiento de ARNm afectan la tasa de traducción de proteínas. Los nematodos mutantes de tipo salvaje y edc-3 que expresaban GFP pan-neuronalmente fueron examinados para detectar su capacidad de recuperación tras el fotoblanqueo dirigido en la región principal. La recuperación fluorescente es mucho más lenta en animales con deficiencia de edc-3 en comparación con los gusanos de tipo salvaje.
La modulación de síntesis de proteínas es esencial para la homeostasis organismal. Durante el envejecimiento, se perturba la síntesis de proteínas globales y específicas. El equilibrio de traducción de proteínas controla directamente la senescencia y el envejecimiento.
Específicamente, los componentes principales de la maquinaria de traducción, así como los componentes que interactúan con el cuerpo P aceleran el proceso de envejecimiento. La perturbación de la iniciación de la traducción desacelera el envejecimiento. Por lo tanto, medir las tasas globales de síntesis de proteínas por FRAP es una lectura directa del proceso de envejecimiento.
