A taxa de síntese proteica é perturbada durante a doença e o envelhecimento. A recuperação da fluorescência após o fotobleaching, ou FRAP, permite a medição da taxa de síntese proteica in vivo. Usamos vermes C.elegans transparentes, que expressam GFP, como modelo para monitorar a nova síntese proteica após fotobleaching.
Fornecemos diretrizes práticas para medir a recuperação da fluorescência usando vermes transgênicos, que expressam GFP sob diferentes promotores, amplamente expressos ou em células ou tecidos específicos. Além disso, este método oferece monitoramento de velocidade de síntese proteica em tempo real. Use um estereótipo dissecando para avaliar os estágios de desenvolvimento e o crescimento de nematoides transgênicos do tipo selvagem e mutantes.
Escolha 10 larvas L4 de animais transgênicos selvagens e mutantes carregando o repórter fluorescente desejado em placas de mídia de crescimento de nematoide semeadas com E.coli. Incubar e cultivar os nematoides à temperatura padrão de 20 graus Celsius. Quatro dias depois, a placa contém uma população mista de vermes transgênicos.
Selecione e transfira 15 larvas L4 de cada cepa em placas op50 NGM recém-semeadas. Realize o ensaio FRAP e monitore a taxa de síntese de proteínas no primeiro dia da idade adulta. No dia seguinte, prepare e use placas de GNM contendo cicloheximida como um controle positivo.
Mate bactérias expondo as placas de NGM semeadas por 15 minutos com luz UV. Adicione cicloheximida na parte superior das placas bacterianas também 500 microgramas por mL concentração final no volume do ágar. Deixe as placas secarem.
Transfira nematoides transgênicos expressando GFP em placas de veículo e cicloheximida. Incubar animais por duas horas na temperatura padrão de 20 graus Celsius. Escolha e transfira animais transgênicos adultos de um dia para placas individuais de GNM semeadas com uma queda de 20 microliters OP50 no centro.
Remova a tampa e coloque cada placa sob uma lente objetiva de 20H de um microscópio epifluorescente. Concentre-se e capture uma imagem de referência antes de fotobleaching. Fotobleach cada amostra por 10 minutos.
Capture uma imagem após fotobleaching. Mantenha os animais em placas de GNM individuais, e deixe-os se recuperar. Imagem e registro da recuperação de cada repórter fluorescente a cada uma hora por pelo menos seis horas em um estereóscópio epifluorescente.
Prepare 2% das almofadas de agarose e adicione 10 microliters drop de tampão M9 no centro da almofada agarose. Transfira cinco nematoides transgênicos expressando GFP citoplasmica pan-neuronal em uma gota de tampão M9. Use um cílio para espalhar o líquido.
Os animais apresentam movimentos reduzidos em dois minutos por causa da absorvância M9 no ágar. Mude a posição do nematoide usando uma picareta de cílios. Coloque a amostra na lente objetiva de 40H de um microscópio epifluorescente sem o uso de um deslizamento de tampa.
Concentre-se e capture uma imagem de referência. Fotobleach uma área de interesse alvo por 90 segundos. Capture uma imagem após fotobleaching.
Adicione uma gota de 10 microliters de tampão M9 em nematoides fotobleachados. Deixe os animais se recuperarem por cinco minutos. Use a picareta de cílios ou uma pipeta para transferir os nematoides para placas ngm individuais semeadas com 20 microliters OP50 drop no centro.
Capture uma imagem de cada amostra a cada uma hora sob um estereóscópio epifluorescente. Vermes mutantes do tipo selvagem e fe-2 expressando GFP citoplasmático em seus tecidos somáticos usando o promotor fe-2 foram comparados antes, imediatamente após fotobleaching, e cinco horas após a recuperação. Animais selvagens totalmente recuperados enquanto os mutantes fe-2 tinham a capacidade de recuperação de minis.
Assim, vermes do tipo selvagem iniciam a síntese de proteínas normal após a fotobleaching, enquanto os vermes sem fator de iniciação de tradução mRNA fe-2 são incapazes de fazê-lo, indicando que a taxa de recuperação fluorescente ilustra a taxa de síntese proteica in vivo. Cicloheximida, um inibidor específico da tradução mRNA pode ser usado como um controle positivo para a inibição da tradução de proteínas. De fato, animais transgênicos tratados com cicloheximida que expressam GFP citoplasmica sob o promotor não recuperam sua fluorescência após a fotobleaching.
Os corpos de processamento de mRNA afetam a taxa de tradução de proteínas. Nematoides mutantes do tipo selvagem e edc-3 expressando GFP pan-neuronalmente foram examinados para sua capacidade de recuperação após fotobleaching direcionado na região da cabeça. A recuperação fluorescente é muito mais lenta em animais deficientes edc-3 em comparação com vermes do tipo selvagem.
A modulação da síntese proteica é essencial para a homeostase do organismo. Durante o envelhecimento, a síntese de proteínas globais e específicas é perturbada. O equilíbrio de tradução de proteínas controla diretamente a senescência e o envelhecimento.
Especificamente, componentes centrais da máquina de tradução, bem como componentes de interação P-body aceleram o processo de envelhecimento. Perturbação da iniciação da tradução desacelera o envelhecimento. Assim, medir as taxas globais de síntese de proteínas pelo FRAP é uma leitura direta do processo de envelhecimento.
