タンパク質合成の速度は、疾患や老化の間に摂動されます.光漂白後の蛍光回復、またはFRAPは、生体内でのタンパク質合成速度の測定を可能にする。GFPを発現する透明C.elegansワームを、光漂白後の新規タンパク質合成を監視するモデルとして使用しています。
広く発現している、あるいは特定の細胞や組織でGFPを発現するトランスジェニックワームを用いて、蛍光回復を測定するための実践的なガイドラインを提供しています。また、この方法は、リアルタイムでタンパク質合成速度の監視を提供します。解剖用実体顕微鏡を用いて、野生型および変異型トランスジェニック線虫の発生段階および成長を評価する。
目的の蛍光レポーターを運ぶ野生型および変異型トランスジェニック動物の10 L4幼虫を、大腸菌を播種した線虫成長培地プレートにピックします。20°Cの標準温度で線虫をインキュベートし、成長させます。4日後、プレートにはトランスジェニックワームの混合集団が含まれています。
選択し、新しく播種OP50 NGMプレート上の各株の15 L4幼虫を転送します。FRAPアッセイを行い、成人の1日目にタンパク質合成速度を監視します。翌日、サイクロヘキシミド含有NGMプレートを陽性対照として調製して使用する。
播種したNGMプレートをUV光で15分間曝露して細菌を殺す。細菌種プレートの上にシクロヘキシミドを加え、寒天体積のmL最終濃度あたり500マイクログラムを加えすぎる。プレートを乾燥させます。
GFPを発現するトランスジェニック線虫を車両およびシクロヘキシミド含有プレートに伝達する。摂氏20度の標準温度で2時間の動物をインキュベートします。1日成虫トランスジェニック動物を、中央に20マイクロリットルOP50ドロップで播種した個々のNGMプレートに移します。
蓋を取り外し、各プレートを蛍光顕微鏡の20H対物レンズの下に置きます。フォトブリーチの前に、参照画像にフォーカスを当ててキャプチャします。各サンプルを10分間フォトブリーチします。
フォトブリーチ後に画像をキャプチャします。動物を個々のNGMプレートに保管し、回復させます。各蛍光レポーターの回収を1時間おきに、少なくとも6時間、蛍光顕微鏡で画像化・記録します。
2%アガロースパッドを準備し、アガロースパッドの中央にM9バッファの10マイクロリットルのドロップを追加します。汎神経細胞質GFPを発現する5つのトランスジェニック線虫をM9バッファーの低下に移す。まつげを使って液体を広げます。
動物は寒天へのM9吸収性のために2分以内に減少した動きを表示する。まつげピックを使用して線虫の位置を変更します。カバースリップを使用せずに、蛍光顕微鏡の40H対物レンズにサンプルを置きます。
参照イメージにフォーカスを当ててキャプチャします。対象領域を 90 秒間フォトブリーチします。フォトブリーチ後に画像をキャプチャします。
フォトブリーチ線虫にM9バッファを10マイクロリットル落とします。動物は5分間回復してみましょう。まつげピックまたはピペットを使用して、ネマトデスを中央に20マイクロリットルOP50ドロップで播種した個々のNGMプレートに移します。
各サンプルの画像を1時間ごとに、蛍光体顕微鏡で撮影します。fe-2プロモーターを用いて体細胞組織全体に細胞質GFPを発現する野生型およびfe-2変異型ワームを、前、光漂白直後、および5時間後の回復と比較した。野生型動物は完全に回復し、fe-2変異体はミニ回収能力を持っていた。
このように野生型ワームは、光漂白後に正常なタンパク質合成を開始し、mRNA翻訳開始因子fe-2を欠いたワームは、そうすることができないが、蛍光回復の速度が生体内でのタンパク質合成の速度を示すことを示す。シクロヘキシミドは、mRNA翻訳の特異的阻害剤であり、タンパク質翻訳阻害の陽性対照として使用することができる。実際、シクロヘキシミド処理したトランスジェニック動物は、プロモーターの下で細胞質GFPを発現し、光漂白時に蛍光を回復しない。
mRNA処理体はタンパク質翻訳速度に影響を与えます。GFP汎ニューロンを発現する野生型およびedc-3変異線虫を、頭部領域における標的光漂白時の回復能力について検討した。蛍光回復は、野生型のワームに比べてedc-3欠乏動物でははるかに遅い。
タンパク質合成変調は、生体恒常性に不可欠です。老化の間に,グローバルなタンパク質合成と特異的なタンパク質合成が摂動される。タンパク質翻訳バランスは、老化と老化を直接制御します。
具体的には、翻訳機械のコアコンポーネントとP-body相互作用コンポーネントが老化プロセスを加速します。翻訳開始の摂動は老化を減速させる。したがって、FRAPによるグローバルタンパク質合成速度の測定は、老化プロセスの直接の読み出しです。
