Die Rate der Proteinsynthese wird während der Krankheit und Alterung gestört. Die Fluoreszenzrückgewinnung nach dem Photobleichen (FRAP) ermöglicht die Messung der Proteinsyntheserate in vivo. Wir verwenden transparente C.elegans Würmer, die GFP exprimieren, als Modell, um die neuartige Proteinsynthese nach dem Photobleichen zu überwachen.
Wir bieten praktische Leitlinien zur Messung der Fluoreszenzrückgewinnung mithilfe transgener Würmer, die GFP unter verschiedenen Promotoren ausdrücken, die entweder weit verbreitet sind oder in bestimmten Zellen oder Geweben enthalten sind. Außerdem bietet diese Methode eine Überwachung der Proteinsynthesegeschwindigkeit in Echtzeit. Verwenden Sie ein sezierendes Stereomikroskop, um die Entwicklungsstadien und das Wachstum von wildtypigen und mutierten transgenen Nematoden zu bewerten.
Wählen Sie 10 L4-Larven von wildtypigen und mutierten transgenen Tieren, die den gewünschten fluoreszierenden Reporter auf mit E.coli gesäten Nematoden-Wachstumsmedienplatten tragen. Die Nematoden bei der Standardtemperatur von 20 Grad Celsius bebrüten und anbauen. Vier Tage später enthält die Platte eine gemischte Population von transgenen Würmern.
Wählen und übertragen Sie 15 L4-Larven jeder Sorte auf frisch gesäte OP50 NGM-Platten. Führen Sie FRAP-Assay durch und überwachen Sie die Proteinsyntheserate am ersten Tag des Erwachsenenalters. Am nächsten Tag Cycloheximid-haltige NGM-Platten als Positivkontrolle vorbereiten und verwenden.
Töten Sie Bakterien, indem Sie die gesäten NGM-Platten für 15 Minuten mit UV-Licht freisetzen. Fügen Sie Cycloheximid auf der Oberseite der bakteriellen Platten zu 500 Mikrogramm pro ml Endkonzentration im Agarvolumen hinzu. Platten trocknen lassen.
Transgene Nematode, die GFP exzessiieren, auf Fahrzeug- und Cycloheximid-haltige Platten übertragen. Brüte Tiere zwei Stunden lang bei der Standardtemperatur von 20 Grad Celsius. Pflücken und übertragen Sie eintägige transgene Tiere aus gewachsenen Tieren auf einzelne NGM-Platten, die mit einem 20-Mikroliter-OP50-Tropfen in der Mitte gesät sind.
Entfernen Sie den Deckel und legen Sie jede Platte unter eine 20H Objektivlinse eines Epifluoreszenzmikroskops. Fokussieren und erfassen Sie ein Referenzbild vor dem Photobleichvorgang. Photoble jede Probe für 10 Minuten.
Erfassen Sie ein Bild nach dem Photobleichvorgang. Halten Sie die Tiere in einzelnen NGM-Platten, und lassen Sie sie sich erholen. Bild und aufzeichnung die Genesung jedes fluoreszierenden Reporters alle eine Stunde für mindestens sechs Stunden an einem epifluoreszierenden Stereomikroskop.
Bereiten Sie 2%Agarose-Pads vor und fügen Sie 10 Mikroliter M9-Puffer in der Mitte des Agarose-Pads hinzu. Übertragen Sie fünf transgene Nematoden, die panneuronale zytoplasmatische GFP exdrücken, in einen Tropfen M9-Puffer. Verwenden Sie eine Wimper, um die Flüssigkeit zu verbreiten.
Tiere zeigen reduzierte Bewegungen innerhalb von zwei Minuten wegen M9-Absorption in den Agar. Ändern Sie die Position der Nematode mit einer Wimpernauswahl. Platzieren Sie die Probe an der 40H Objektivlinse eines Epifluoreszenzmikroskops, ohne einen Abdeckschlupf zu verwenden.
Fokussieren und erfassen Sie ein Referenzbild. Photoblebmittel ein zielgerichtetes Interesse für 90 Sekunden. Erfassen Sie ein Bild nach dem Photobleichvorgang.
Fügen Sie einen 10 Mikroliter-Tropfen M9-Puffer auf photobleached Nematoden hinzu. Lassen Sie die Tiere für fünf Minuten erholen. Verwenden Sie die Wimpernpicke oder eine Pipette, um die Nematoden auf einzelne NGM-Platten zu übertragen, die mit 20 Mikrolitern OP50 in der Mitte gesät sind.
Erfassen Sie alle eine Stunde ein Bild jeder Probe unter einem epifluoreszierenden Stereomikroskop. Wildtyp- und Fe-2-Mutantenwürmer, die zytoplasmatisches GFP in ihrem gesamten somatischen Gewebe mit Dem fe-2-Promotor exzättierten, wurden vor, unmittelbar nach der Photobleiche und fünf Stunden nach der Wiederherstellung verglichen. Wildtiere erholten sich vollständig, während fe-2 Mutanten die Erholungskapazität der Minis hatten.
So initiieren Wild-Typ-Würmer die normale Proteinsynthese nach dem Photobleichen, während Würmer ohne mRNA-Translationsinitiationsfaktor fe-2 dazu nicht in der Lage sind, was darauf hindeutet, dass die Rate der fluoreszierenden Erholung die Rate der Proteinsynthese in vivo veranschaulicht. Cycloheximid, ein spezifischer Inhibitor der mRNA-Translation, kann als positiv auf die Proteintranslationshemmung verwendet werden. Tatsächlich erholen cycloheximidbehandelte transgene Tiere, die unter dem Promotor zytoplasmatischeS GFP exdrücken, ihre Fluoreszenz beim Photobleichen nicht wieder.
mRNA-Verarbeitungskörper beeinflussen die Rate der Proteintranslation. Wildtyp- und edc-3-mutante Nematoden, die GFP panneuronal exdrücken, wurden auf ihre Erholungsfähigkeit bei gezielter Photobleichung im Kopfbereich untersucht. Fluoreszierende Erholung ist viel langsamer bei edc-3-mangelhaften Tieren im Vergleich zu Wild-Typ-Würmer.
Die Proteinsynthesemodulation ist für die Muskelhomöostase unerlässlich. Während des Alterns wird die globale und spezifische Proteinsynthese gestört. Protein-Translation Balance steuert seneszenz und alterungdirekt.
Insbesondere die Kernkomponenten der Übersetzungsmaschinerie sowie p-körper interagierende Komponenten beschleunigen den Alterungsprozess. Die Störung der Übersetzungsinitiation verlangsamt das Altern. Daher ist die Messung der globalen Proteinsyntheseraten durch FRAP eine direkte Auslesung des Alterungsprozesses.
