Este protocolo demuestra visualmente cómo establecer un sistema de cultivo fiable a largo plazo para la tunicada pelágica marina Oikopleura dioica. El sistema de cultivo de Oikopleura proporciona los recursos básicos para investigar una amplia gama de campos biológicos relacionados con la ecología, el desarrollo, la genómica y la evolución. Esta especie tiene un ciclo de vida corto, alta fecundidad, y se puede recoger fácilmente de la orilla, por lo que es un excelente organismo modelo.
Aunque este protocolo está optimizado para O.dioica, esperamos que se pueda aplicar a otros organismos planctónicos. Para empezar, inicie alimentos de algas para mantener el cultivo de Oikopleura, comenzando por el autoclaving de agua de mar filtrada. Para iniciar un cultivo de Chaetoceros calcitrans, 60 milésimas de agua de mar autoclaved se complementaron con los siguientes: 30 microlitros de vitaminas, 30 microlitros de solución A, 15 microlitros de silicato de sodio y 60 microlitros de estreptomicina.
Finalmente, se añadieron 30 microlitros de C.calcitrans de un cultivo de stock anterior como inoculante. Consulte la tabla dos del manuscrito con respecto a los volúmenes de suplemento e inoculación para las otras especies de algas y tipos de cultivo. Después de la inoculación, el stock y las subculturas se mantienen en una incubadora a 17 grados Centígrados con iluminación continua.
Después de aproximadamente 10 días, el crecimiento de algas se confirma por los matraces que se colorean. Cuando esto ocurra, mueva las culturas de stock a un almacenamiento a largo plazo a cuatro grados centígrados durante un mes mientras mantiene la subcultura en la misma incubadora. Para crear un cultivo de trabajo, añadir los suplementos necesarios a 400 mils de agua de mar autoclavada e inocular con 100 mils de la subcultura anterior.
Selle el matraz con una tapa de goma, inserte una pipeta desechable de un mil y muévalos a una estación de algas y mantenlos a temperatura ambiente con un fotoperiodo de ocho horas y una aireación constante. Remolino manualmente cultivos de algas dos veces al día para evitar la agregación en la parte inferior del matraz. Una vez que se hayan establecido los cultivos de algas, recoja muestras de campo en un sitio local.
Lanzar una red de plancton, y permitir que el extremo del bacalao se hunda de uno a dos metros por debajo de la superficie. Remolque de la red a una velocidad de aproximadamente 5 a un medidor por segundo. Continúe remolcando de ida y vuelta durante entre dos y cinco minutos.
El tiempo de remolque debe ajustarse de acuerdo con la abundancia de plancton en el lugar. Después del remolque, levante cuidadosamente la red y transfiera lentamente el contenido del extremo del bacalao a una botella de vidrio de 500 mil. Llene la botella hasta el borde para evitar burbujas de aire que podrían causar estrés a los animales durante el transporte.
En esta etapa, la presencia de Oikopleura se puede confirmar viendo las botellas de muestra sobre un fondo oscuro. Sin embargo, se requiere una observación microscópica para la identificación a nivel de especie. Repita este proceso hasta que se hayan recogido tres botellas de 500 mil.
Recoja el agua de mar superficial para registrar la salinidad, la temperatura y la concentración de clorofila con un perfilador CTD. Además, recoger de 10 a 15 litros de agua de mar en el lugar para ayudar a aclimatar a los animales a las condiciones de laboratorio. Para aclimatar a los animales, prepare una relación uno a uno de agua de mar superficial del sitio de la muestra y el agua de mar filtrada mantenida en el laboratorio.
El volumen final debe ajustarse a entre cinco y 10 litros, dependiendo de la concentración de la muestra de plancton. Agregue cuidadosamente la muestra de 500 mil al vaso de precipitados preparado. Usando una paleta unida a un motor síncrono girando a 15 RPM, mantenga el plancton en suspensión durante la noche.
A la mañana siguiente, compruebe la presencia de Oikopleura a simple vista. Transfiera a los animales a un plato de Petri, y observe bajo un microscopio de campo oscuro establecido entre aumento de 20 a 40 veces para una identificación positiva. Oikopleura se caracterizan por animales en forma de renacuajo ondulando sus colas dentro de una casa translúcida.
Para confirmar O.dioica, busca machos completamente maduros con gónadas amarillas o hembras con huevos. Si los animales son inmaduros, busque la presencia de dos células subchorálticas en la mitad distal de la cola. Estos están presentes en animales maduros e inmaduros.
Una vez confirmada la especie, transfiéralas a un nuevo plato de Petri. Repita este proceso hasta que se hayan confirmado entre 10 y 20 individuos a nivel de especie. Si no se encuentra O.dioica, mantenga el vaso de precipitados revolviendo durante uno o dos días más.
Los pequeños O.dioica que inicialmente no eran observables seguirán creciendo y serán más fáciles de ver. Si no aparece ninguno después de una semana, deseche la muestra e intente tomar el muestreo de nuevo. Para establecer un monocultivo, aísle 120 O.dioica de una muestra de campo en cinco litros de agua de mar filtrada.
A la mañana siguiente, busca machos completamente maduros identificados por gónadas amarillas y hembras con huevos que aparezcan como esferas doradas brillantes. Preparar un vaso de precipitados mediante la transferencia suave de 15 machos y 30 hembras con una pipeta de cinco mil de punta roma a un vaso de precipitados que contiene 2,5 litros de agua de mar filtrada. Para minimizar el estrés físico durante la transferencia manual, suelte lentamente los animales bajo la superficie del nuevo agua de mar.
Permita que los adultos aislados desoven naturalmente. Después del desove, la fertilización exitosa se puede confirmar extrayendo de cinco a 10 mils de agua de mar del fondo del vaso de precipitados e identificando huevos con escotes bajo un microscopio. En la primera mañana después del desove, primer día, una nueva generación de animales jóvenes con casas infladas debe aparecer en el vaso de precipitados.
Utilice un vaso de precipitados portátil de 500 mil para transferir suavemente a los animales a un vaso de precipitados nuevo que contenga 7,5 litros de agua de mar fresca y filtrada. Verter lentamente el contenido en la superficie para minimizar las turbulencias y las fuerzas de cizallamiento. En la segunda mañana después del desove, el segundo día, transfiera manualmente 150 animales a un vaso de precipitados nuevo que contenga cinco litros de agua de mar fresca y filtrada.
En la tercera mañana después del desove, día tres, transfiera manualmente 120 animales a un nuevo vaso de precipitados con cinco litros de agua de mar fresca y filtrada. Para el cuarto día, los animales adultos sexualmente maduros deben estar presentes. Recoger 15 machos y 30 hembras para un nuevo vaso de desove con 2,5 litros de agua de mar filtrada para iniciar la próxima generación.
Este proceso se repite y se mantiene para la vida de la cultura. Con el fin de mantener un monocultivo de O.dioica, los alimentos de algas se preparan diariamente a partir de las culturas de trabajo. Los animales son alimentados tres veces al día.
Preparar alimentos diarios midiendo la absorbancia del cultivo de trabajo utilizando un espectrofotómetro establecido en 660 nanómetros. Los valores de absorción, los volúmenes de cultivo de O.dioica objetivo y la madurez animal se colocan en una hoja de cálculo preparada sobre la base de una curva de crecimiento de algas previamente determinada para calcular el volumen exacto de algas necesarias para la alimentación del día. Pipetear los volúmenes calculados en tubos de 50 mil, y centrifugar a 5.000 g durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Lentamente verter sobrenadante, y cuidadosamente pipetear hacia arriba y hacia abajo para resuspender las algas peletadas. Rellene los tubos a su volumen original con agua de mar fresca y filtrada. Basado en la tabla diaria de alimentación de algas de la hoja de cálculo, alimentar la cantidad especificada a cada vaso de precipitados a 9 a.m.
12 p.m. y 5 p.m. Se puede configurar una bomba dosificadora automatizada para alimentar a los animales a las 5 p.m.
los fines de semana sin la presencia de personal de cultivo. Después de cada alimentación, mantenga los alimentos de algas preparados a cuatro grados centígrados hasta que estén listos para ser utilizados para el próximo alimento. O.dioica se puede recoger de un puerto mediante el suave remolque de una red de plancton modificada equipada con malla de 100 micras y un extremo de bacalao sin filtrado.
El muestreo entre 2015 y 19 mostró variación estacional en presencia de O.dioica en los puertos de Okinawa. La temperatura del agua de mar superficial parecía influir en la presencia de los animales. O.dioica dominó cuando la temperatura del agua de mar superficial era de 28 grados o más.
O.dioica coexistió con Oikopleura longicauda a temperaturas entre 24 y 27 grados. Sin embargo, O.longicauda dominó a temperaturas inferiores a 23 grados. Los cambios en la salinidad no se correlacionaron con la abundancia de O.dioica.
Los tres factores más importantes para establecer sistemas estables de cultivo de O.dioica son el mantenimiento de una alta calidad del agua con un sistema de filtración de varios pasos, identificando un régimen de alimentación óptimo, preferiblemente mediante la creación de curvas estándar de algas, y la preparación de vasos de desove con un número suficiente de machos y hembras. Siguiendo el protocolo proporcionado, el ciclo de vida de O.dioica es de cuatro días a 23 grados. Hemos establecido de forma fiable seis poblaciones independientes de O.dioica, todas las cuales duraron más de 20 generaciones.
En conclusión, el establecimiento de una cultura estable de O.dioica se puede hacer de manera rápida y rentable. Con una configuración adecuada, se puede lograr una cultura estable dentro de una semana. Junto con su pequeño genoma y ciclo de vida rápido, esto hace de O.dioica una poderosa especie modelo de acordeado.
O.dioica se puede mantener tanto en agua de mar artificial como natural. El almacenamiento a largo plazo de alimentos de algas es posible utilizando cultivo sólido y criopreservación. Además, los espermatozoides O.dioica también pueden ser crioconservados y permanecer viables durante más de un año.
O.dioica continúa proporcionando una poderosa visión de varios campos biológicos. Una comprensión de la estacionalidad local, un sistema de cultura meticuloso y algunos individuos dedicados permiten que la cultura efectiva se establezca con poco esfuerzo.
