La disponibilidad de organismos modelo culturables ha sido fundamental para el avance en muchos campos de estudio. Este protocolo, a nuestro conocimiento, es el único enfoque disponible para el cultivo de Doliolids. La tecnología de cultivo confiable de Doliolid proporciona un modelo experimental único para estudiar organismos que son importantes para algunas de las regiones más productivas del océano y que representan los primeros ancestros evolutivos de vertebrados.
Esta técnica es única ya que mantiene las partículas de alimentos de algas y los organismos suspendidos en la columna de agua sin contacto con las paredes del recipiente como experimentan en la naturaleza. Este método de cultivo se puede aplicar al cultivo de otras pequeñas especies gelatinosas y crustáceos o plancton. Debido a que los Doliolids tienen un ciclo de vida complejo, entender y reconocer las necesidades de cada etapa de la vida es fundamental.
Aprender el ciclo de vida y cómo reconocerlos y manejarlos requiere mucha práctica. En nuestra experiencia, la única manera de aprender esta técnica de cultivo es verla y hacerlo. Varios otros participantes del proyecto como Erin Arneson, Nicholas Castalaine, Natalia Lopez, Lauren Lamboye, Briana Pierce, Arya Rodriguez-Santiago y Terrell Scarborough también aparecieron brevemente en este video.
Antes de establecer y criar cultivos de Doliolid en el laboratorio, limpie y esterilizar frascos de cultivo de vidrio de 1,9 y 3,8 litros sumergiéndolos en la solución de permanganato de potasio hidróxido de sodio. Deje que los frascos se empapen durante la noche. A continuación, transfiera los frascos a la solución de bisulfito de sodio.
Deje que los frascos se empapen durante la noche. A continuación, enjuague bien los frascos con agua desionizada. Deje que los frascos se sequen.
Para mantener los cultivos de stock, utilice técnicas rigurosas de cultivo axenico. Cada dos semanas transfiere 0,5 mililitros de antiguo cultivo senescente a 25 mililitros de medios de crecimiento fresco en tubos estériles de cultivo de vidrio de 55 mililitros. Para preparar volúmenes más grandes de fitoplancton para alimentar a los dolílidos, transfiera cuatro mililitros del fitoplancton de axetónicos a matraces de cultivo de tejido plástico de 500 mililitros que contengan 200 mililitros de medios de crecimiento para inocular de uno a 50 dilución.
Incubar el cultivo en una incubadora ambiental o cámara ambiental a 20 grados centígrados con un ciclo de luz-oscuridad de 12 a 12 horas bajo una iluminación de luz blanca fría de 65 a 85 microEinsteins por metro cuadrado. Matraces de cultivo de la plantan para maximizar la iluminación. Arremolina suavemente la cultura todos los días.
Dirígete al mar. Para localizar Doliolids en la plataforma continental, despliegue el instrumento oceanográfico CTD para identificar las condiciones del agua que favorezcan la presencia de Doliolids mediante el perfil de la temperatura del agua, la salinidad y la clorofila A fluorescencia. Confirme las condiciones del agua mediante la realización de remolques de red exploratorios con redes de plancton especializadas.
Alternativamente, utilice un sistema de imágenes de generación de perfiles in situ para detectar Doliolids. Ahora opera el cabrestante para recuperar el CTD. Las botellas de Niskin montadas en la roseta CTD recolectaban agua de mar del sitio donde se encuentran los Doliolids y a la profundidad que contiene las estimaciones más altas de clorofila.
Enjuague tres cubos de 22 litros con agua de mar y lléne con agua de mar a un poco más de la mitad. Llene el extremo del bacalao neto completamente con agua de mar y conecte el extremo del bacalao a la red. Despliegue la red.
Bajar y elevar la red a través de la columna de agua, manteniendo un ángulo de remolque oblicuo de 15 a 25 grados y una velocidad de despliegue y recuperación vertical no superior a 15 metros por minuto. Una vez que la red está a bordo, transfiera y divida suavemente el contenido del extremo del bacalao en los cubos de plástico, cada uno de los que contienen agua de mar superficial recogida del sitio. Con una pipeta de vidrio de diámetro ancho, mezcle suavemente el contenido del vaso de precipitados con la pipeta utilizando movimientos verticales y horizontales.
Con el dedo índice, crea succión capilar para capturar y transferir Doliolids. Captura los Doliolids del fitoplancton mixto en el vaso de precipitados. Después de la adición de Doliolids, añadir el cultivo de Rhodomonas en el frasco a una concentración final de aproximadamente cinco veces 10 a la tercera a 10 a las cuartas células por mililitro.
Compruebe el color del tracto digestivo de Doliolids. El color rojo determina que los Doliolids se alimentan activamente. Para evitar que los Doliolids queden atrapados en la interfaz aire-agua, llene completamente los frascos con agua de mar sin filtrar y rica en partículas para evitar el espacio de la cabeza.
Coloque un trozo de envoltura de plástico sobre la abertura del frasco. Evite crear burbujas de aire que también puedan dañar a los animales. Atornille cuidadosamente la tapa en el frasco e invierta suavemente el frasco para determinar si hay burbujas presentes.
Si hay burbujas, llene más agua de mar para eliminarlas. Después de que los frascos se llenan de resalto con la tapa y limpiar el exceso de agua desde el exterior del frasco. Monte cada frasco en la rueda de plancton colocando el frasco en las barras metálicas verticales cubiertas con tubos de goma y entre una abrazadera de manguera de acero inoxidable.
Asegúrese de que la parte posterior del frasco esté acolchada contra el tubo de goma. Ajuste el tornillo para apretar la abrazadera de la manguera alrededor del frasco. Deje que los frascos giren a 0,3 rpm para mantener los Doliolidos en suspensión.
Después de tres días de aclimatación a las condiciones de laboratorio, transfiera de 100 a 150 mililitros de agua de cultivo desde el frasco a un recipiente de muestra y mida la concentración de algas utilizando un contador de Coulter. Sobre la base de la estimación de la concentración de algas, añadir suficientes algas para llevar la concentración en el frasco de cultivo a 40 a 95 microgramos de carbono por litro. Utilice el contador de partículas para monitorear las concentraciones de algas después de que los Doliolids se hayan estado alimentando para guiar la decisión de con qué frecuencia y cuántas algas añadir a los cultivos.
Mantener las concentraciones de fitoplancton en los frascos de cultivo entre 40 y 95 microgramos de carbono por litro. Cultivar Doliolids requiere apoyarlos a través de su complicado ciclo de vida. Desarrollar larvas y oozooides y enfermeras tempranas.
Una vez que un mínimo de ocho trofozooides son visibles en la cataforma de la enfermera, transfiera al menos cuatro enfermeras a un nuevo frasco de cultivo. Una vez que los fonzooides alcancen tres milímetros de tamaño, reduzca el número de animales en el frasco. Cuando los forozooides se hacen más grandes que cinco milímetros y han desarrollado racimos gonozooides eliminar todos menos cuatro forozooides.
Este protocolo proporciona una visión general de un enfoque de recolección y cultivo de Dolioletta gegenbauri. Las tasas de aclaramiento de algas fueron similares en concentraciones de 20 a 60 microgramos de carbono por litro y disminuyeron a medida que aumentaban las concentraciones de alimentos. Las tasas de aclaramiento aumentaron proporcionalmente en los rangos de temperatura que apoyan el crecimiento de D.gegenbauri.
Se observaron tasas de crecimiento que oscilan entre 0,1 y 0,7 milímetros por día en función de la temperatura y la disponibilidad de alimentos. El cultivo de Doliolids depende de replicar con éxito las condiciones oceánicas y satisfacer las necesidades de los animales a lo largo de su complicado ciclo de vida. En consecuencia, se requiere un manejo suave de los animales durante su captura, aislamiento y cría.
Las concentraciones de alimentos deben controlarse con frecuencia y ajustarse. Esto es particularmente cierto durante las etapas de la vida de las larvas en desarrollo y oozooides. Este método está diseñado específicamente para la cría de pequeñas especies de zooplancton en la base de la red de alimentos marinos.
Este método será valioso, por ejemplo, para investigar las respuestas de zooplancton al cambio climático. Desde su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que los ecologistas de zooplancton determinen las tasas de alimentación, crecimiento y reproducción basadas en laboratorio de Doliolids. Además, este método allanó el camino para las investigaciones revolucionarias basadas en la molecular de la dieta Doliolid en la naturaleza.
Me gustaría recordarles que el protocolo de limpieza de vidrio implica reactivos que son irritantes respiratorios y deben utilizarse en zonas bien ventiladas. Trabajar en el mar también puede ser peligroso, así que siga las normas de seguridad del barco.
