JAL fue apoyado por la subvención de los NIH K08EY030923; Cmc fue apoyado por una subvención K01 (5K01AR060169) del Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticos del NIH y una Nueva Beca de Investigación (637405) de la Alianza de Investigación lupus.

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Northwestern. Los ratones C57BL/6 estaban alojados en una instalación de barrera en el Centro de Medicina Comparada de la Universidad Northwestern (Chicago, IL). Todos los animales estaban alojados en ciclo claro/oscuro de 12/12 h con libre acceso a alimentos y agua.
1. Recolección de tejido ocular
<ol><li>Sacrificar ratones C57BL/6J de 10-12 semanas de edad de cualquiera de los dos sexos usando la administración regulada de dióxido de carbono hasta que el ratón no responda y ya no inhale. Realizar dislocación cervical u otro método secundario aprobado para garantizar la eutanasia. NOTA: Se puede realizar perfusión transcardial para eliminar los leucocitos circulantes que no están en los tejidos oculares. En este experimento, la perfusión sistémica no reduce el número de microglia, monocitos, macrófagos o células dendríticas detectadas en ojos enteros sin tratar o tratados con láser. Por lo tanto, la mayoría de estos tipos de células se encuentran en los tejidos oftálmicos y este paso es opcional.</li>
	<li>Para enuclear los ojos, empuje hacia abajo cerca de la cavidad ocular mientras coloca un par de fórceps curvas suavemente debajo del ojo mientras se destaca de la cavidad. Pellizcar fórceps cerrados debajo del ojo sin apretar el ojo real. Desalojar la vista de la conjuntiva circundante (véase la publicación previa)23.</li>
	<li>Tire del ojo lateralmente hasta que el nervio óptico sea la única conexión restante para separar el ojo. El nervio óptico a menudo se corta con tensión, pero una pequeña tijera a veces es necesaria para cortar el nervio óptico. Coloque el ojo en la solución salina tamponada (HBSS) fría de 1x Hank con calcio y magnesio en tubo de microcentrífuga de 1,7 ml.</li>
</ol>2. Digestión del tejido ocular
<ol><li>Preparar el tampón de digestión que contiene 0,1 mg/mL enzima de digestión y 0,2 mg/ml DNase en HBSS frío. Reconstituir 5 mg de enzima digestión en 2 ml de agua estéril inicialmente. Preparar una dilución inicial de 10 mg/ml de DNase en HBSS. Por cada 10 ml del tampón de digestión (suficiente para 3 animales) mezclar 9,4 ml de HBSS frío con 0,4 ml de enzima de digestión reconstituida y 0,2 ml de DNase I diluido. NOTA: Estas concentraciones se determinaron empíricamente sobre múltiples experimentos para proporcionar niveles óptimos de tinción de anticuerpos de células individuales, al tiempo que se reducía la muerte celular. La colágena D se probó como una alternativa a la enzima digestión con menor viabilidad celular y disminución de las células CD45+. Consulte Discusión para obtener más detalles sobre el proceso iterativo para optimizar la digestión.</li>
	<li>Bajo un microscopio diseccionador a una ampliación total de 10x, retire la conjuntiva y el nervio óptico restantes usando fórceps finos y tijeras de resorte en HBSS frío.</li>
	<li>Mueva los ojos limpios a un plato de disección seco o a un pequeño bote de pesaje. Inyectar 0,15-0,20 ml/ojo de amortiguador de digestión a través de jeringa equipada con aguja de 30 G en la cavidad vítrea después de que dos heridas perforadoras se hacen en el ojo a través del eje visual y a 90° de distancia de esta primera herida para la salida del búfer de digestión.</li>
	<li>Ojos enteros mince usando tijeras de resorte y fórceps finos con todas las piezas más pequeñas de 0,5 mm x 0,5 mm. Disociar el tejido de la lente con una interrupción mecánica contundente a través de fórceps para evitar la obstrucción de puntas de pipeta en pasos posteriores. Para cada muestra, enjuague los fórceps y tijeras cada uno con 0,75 ml de amortiguador de digestión en un plato pequeño. Use un plato nuevo para cada muestra.</li>
	<li>Transfiera el contenido del plato a un tubo de disociación en hielo utilizando pipeta P1000 teniendo cuidado de no perder ningún material en la transferencia de pipeta. Enjuague el plato con 1,5 ml adicionales de amortiguador de digestión, lo que eleva el volumen total en tubo de disociación a 3,25-3,50 ml.</li>
	<li>Coloque el tubo de disociación invertido en disociador electrónico y ejecute el ciclo "m_brain_03_01", que consiste en una rotación unidireccional de 1 min a 200 rpm a temperatura ambiente, que es un programa precargado. Asegúrese de que todo el tejido esté en la parte inferior del tubo de disociación en contacto con el búfer de digestión y el rotor para este y todos los pasos restantes.</li>
	<li>Coloque el tubo de disociación en la incubadora de agitación durante 30 minutos a 200 rpm a 37 °C.</li>
	<li>Repita los pasos 2.6 y 2.7 una vez más. Después de la segunda incubación de 30 minutos realizar una digestión mecánica final utilizando disociador electrónico como en el paso 2.6.</li>
	<li>Detenga la reacción añadiendo 10 ml de amortiguador de flujo frío y coloque tubos sobre hielo.</li>
</ol>3. Preparación de la suspensión celular
<ol><li>Para crear la suspensión de una sola célula, vierta la reacción de digestión ocular detenida a través de un filtro de 40 μm colocado en la parte superior de un tubo centrífugo cónico de 50 ml. Usando el émbolo de una jeringa de 2,5 ml, empuje cualquier pedazo restante de tejido ocular indigno a través del filtro.</li>
	<li>Lave el tubo de disociación con 10 ml de tampón flow y enjuague el filtro antes de usar el mismo émbolo para pasar de nuevo piezas de tejido ocular no digerida a través del filtro.</li>
	<li>Repita el paso 3.2 usando 5 mL de búfer de flujo.</li>
	<li>Lave el tubo de disociación y filtre con un amortiguador final de 10 ml de flujo. NOTA: El volumen total de digestión y búfer de flujo es de aproximadamente 38-40 ml para cada muestra.</li>
	<li>Centrífuga el tubo cónico a 400 x g durante 10 min a 4 °C. Decantar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular.</li>
	<li>Prepare la solución de lysing 1x añadiendo solución de lisante de 10x al agua estéril. Rompe el pellet moviendo el tubo contra otro tubo. Para liar los glóbulos rojos, añadir 1 ml de solución de lisante 1x para 30 s con remolino a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Detenga la reacción con 20 ml de búfer de flujo.</li>
	<li>Centrífuga el tubo cónico a 400 x g durante 10 min a 4 °C. Decantar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular.</li>
	<li>Disociar el pellet moviendo el tubo contra otro tubo. Añadir 5 ml de frío 1x HBSS por tubo.</li>
	<li>Tubos centrífugas a 400 x g durante 10 min a 4 °C. Aspirar supernadante.</li>
</ol>4. Tinción de la suspensión celular para fagocitos mononucleares
<ol><li>Prepare 0,5 ml de mancha viva/muerta por muestra diluyendo el tinte vivo/muerto 1:5.000 en HBSS frío.</li>
	<li>Agregue la mancha Live/Dead a cada muestra usando una pipeta P1000 asegurándose de disociar el pellet por completo. Transfiera muestras a tubos de micro titulaciones de 1,2 ml.</li>
	<li>Tome una pequeña alícuota (10 μL) para contar las células utilizando un hemociclomeciómetro o contador de células automático (ver 4.4). Incuba muestras con mancha viva/muerta durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
	<li>Cuente celdas usando Trypan blue para determinar el número de celdas vivas por muestra. NOTA: Típicamente, 2 ojos de un ratón C57BL/6J de 10-12 semanas de edad contienen menos de 2 x 106 células vivas.</li>
	<li>Lave muestras añadiendo 400 μL de búfer de flujo frío. Tubos centrífugos en un bastidor de tubo de micro titulaciones a 400 x g durante 10 minutos a 4 °C. Aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular.</li>
	<li>Células resuspend completamente en 500 μL de búfer de flujo frío. Tubos centrífugos en un bastidor de tubo de micro titulaciones a 400 x g durante 10 minutos a 4 °C. Aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular.</li>
	<li>Bloquee hasta 5 x 106 células vivas en 50 μL de bloque Fc (dilución de 1:50 en búfer de flujo frío de rata purificada anti-ratón CD16/CD32). Si más de 5 x 106 células vivas, aumente los volúmenes adecuadamente.</li>
	<li>Añadir bloque Fc al pellet asegurándose de disociar completamente la muestra. Incubar durante 20 min a 4 °C.</li>
	<li>Añadir 50 μL de solución de tinción de anticuerpos (ver Tabla 1 para su elección y cantidad de cada anticuerpo que se incluye en la solución) por 5 x 106 células vivas directamente a las células en bloque Fc y mezclar completamente. Incubar durante 30 min a 4 °C. NOTA: Las cantidades de anticuerpos dependen de la configuración del citómetro de flujo y deben valorarse de forma independiente para cada laboratorio e instrumento. Consulte la Tabla 2 para la configuración de instrumentos de filtros y espejos. Para valorar anticuerpos, comience con la recomendación del fabricante y calcule el índice de tinción. Realice una prueba de concentraciones de anticuerpos variables (tanto por encima como por debajo de la recomendación del fabricante) y elija la concentración más baja de anticuerpos donde se mantiene el índice de tinción. Además, asegúrese de que la tinción positiva que es menos brillante que el control de un solo color. Utilice células sin manchar para asegurarse de que las células manchadas negativamente están a escala y tienen un pico en o menos de 1 x 102. Utilice una fluorescencia menos un control para definir las células manchadas positivamente.</li>
	<li>Lave muestras añadiendo 700 μL de búfer de flujo frío. Tubos centrífugos en un bastidor de tubo de micro titulaciones a 400 x g durante 10 minutos a 4 °C. Aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular.</li>
	<li>Opcionalmente, después de la tinción de anticuerpos, las muestras se pueden fijar con 500 μL de paraformaldehído del 2% en el búfer de flujo. Corrija muestras durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, realice un lavado como se describe en 4.10. Almacene muestras fijas a 4 °C. Las cuentas de recuento deben agregarse el día de la recopilación de datos de citometría de flujo. Las muestras fijas deben ejecutarse en el cytómetro de flujo en 1-2 días. PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es un peligro corrosivo y para la salud.</li>
	<li>Lave muestras de nuevo usando 500 μL de búfer de flujo frío. Tubos centrífugos en un bastidor de tubo de micro titulaciones a 400 x g durante 10 minutos a 4 °C. Aspirar la mitad del sobrenadante sin perturbar el pellet celular.</li>
	<li>Resuspend pellets y transferir a un pozo 96, placa de ensayo de fondo en U. Placa centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Para decantar el sobrenadante, gire la placa y en una sacudida fuerte desaloje el líquido en una cuenca del fregadero, sin perturbar el pellet.</li>
	<li>En un nuevo tubo micro titulador de 1,2 ml, coloque 50 μL de cuentas de recuento bien vórtices.</li>
	<li>Pellets resuspend en 96 placa de pozo en 200 μL de amortiguador de flujo frío. Agregue la mezcla celular en la parte superior de las cuentas del paso anterior. Ejecute el citómetro de flujo en un volumen total de 250 μL / tubo de micro titulador.</li>
</ol>5. Recopilación de datos de citometría de flujo
<ol><li>Encienda y prepare el citómetro de flujo. Las instrucciones enumeradas aquí son para un cytómetro láser de cuatro modificados (Tabla 2).</li>
	<li>Ejecute una muestra de prueba, que incluye una pequeña alícuota de cada muestra, para asegurarse de que todas las células están a escala para cada detector. Ajuste los voltajes para que todas las celdas estén a escala.</li>
	<li>Ejecute controles de un solo color (SCC) para cada fluoróforo utilizado en el cóctel de tinción(Tabla 3). Coloque el tubo de micro titulación en un tubo de poliestireno de 5 ml más grande para colocarlo en la etapa del citómetro de flujo. NOTA: Los fluoróforos radiculares como BV421 (Azul Pacífico), FITC, PE, Alexa647 (APC) y Alexa700 no requieren el mismo anticuerpo que el cóctel (es decir, CD19 PE para CD64 PE). Sin embargo, los fluoróforos tándem como PE-CF594, PE-Cy7 o APC-Cy7 requieren el mismo anticuerpo para SCC que el cóctel debido a la posible disociación de los fluoróforos conjugados.<ol>
<li>Cree el SCC para BV421 añadiendo 2 gotas de cuentas de compensación a un tubo de titer de 1,2 ml junto con 1 μL de hámster anti-ratón CD11c BV421. Las cuentas de compensación se utilizan porque CD11c BV421 es un subtipo lambda IgG en lugar de kappa como se describe en 5.3.3. Incubar durante 15 minutos a 4 °C. Agregue 0,2 ml de búfer de flujo.</li>
		<li>Crea el SCC para el tinte Live/Dead añadiendo una gota de cuentas de tinción positivas (tapa verde) a partir de las cuentas reactivas de amina, seguidas de 1 μL de tinte Vivo/Muerto. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Añadir una gota de las cuentas negativas (tapa blanca) de las cuentas reactivas amina. Agregue 0,2 ml de búfer de flujo.</li>
		<li>Cree los SCC restantes añadiendo una gota de cuentas de tinción positivas (tapa verde) del conjunto de cuentas anti-rata y anti-hámster Ig kappa, seguida de la cantidad de anticuerpos enumerada(Tabla 3)en un tubo de titer de 1,2 ml. Incubar durante 15 min a 4 °C. Añadir una gota de las cuentas negativas (tapa blanca) de la anti-rata y anti-hámster Ig kappa conjunto de cuentas. Agregue 0,2 ml de búfer de flujo.</li>
		<li>Vórtice todas las mezclas de cuentas completamente. Almacene los SCCs a 4 °C durante un tiempo de hasta 3 días. NOTA: El SCC para ratones reporteros fluorescentes son células sin manchar.</li>
		<li>Al ejecutar SCCs, establezca voltajes de tal manera que la muestra SCC tenga un pico mayor que cualquier fluorescencia para una muestra de células en el mismo canal detector. Además, se deben fijar tensiones para que cualquier SCC tenga al menos una diferencia de registro de 0,5 entre el pico del histograma en el canal de interés frente a cualquier otro canal (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ejecute muestras en eventos de mantenimiento "Bajos"/segundo por debajo de 4000. Si el caudal no se puede reducir adecuadamente, diluya las muestras con un búfer de flujo frío adicional. Registre el volumen agregado, ya que esto será necesario para el cálculo del recuento (ver resultados representativos).</li>
	<li>Recopile al menos 3 x 106 eventos por muestra. Esto puede ser mayor que el número de células debido a que los gránulos pigmentos y los desechos cuentan como eventos en el cytómetro.</li>
	<li>Registre una Fluorescencia Menos Uno (FMO) para cada fluoróforo que no sea Vivo/Muerto para una estrategia de gating adecuada en la sección 6.4. Una FMO es una muestra que ha sido manchada con todos los fluoróforos excepto uno.</li>
	<li>Limpie y apague el citómetro de flujo de acuerdo con las instrucciones del fabricante o de la instalación.</li>
</ol>6. Anotación de datos de citometría de flujo
<ol><li>Abra una nueva hoja de trabajo mediante el software de análisis. Importe archivos FCS desde el citómetro para todas las muestras y controles de un solo color.</li>
	<li>Utilice SCCs para crear una matriz de compensación.</li>
	<li>Aplique la matriz de compensación a sus muestras manchadas y FMOs.</li>
	<li>Utilice los FMOs para determinar la tinción positiva para dibujar puertas.</li>
</ol>

<ol>
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K., van Rooijen, N., Ambati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+depletion+inhibits+experimental+choroidal+neovascularization.">Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).</li><li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization:+nomenclature+and+experimental+guidelines.">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li><li>Liyanage, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+inflammatory+and+resident+myeloid+populations+in+mouse+ocular+inflammatory+models.">Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models.</a> Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).</li><li>Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cell+Suspensions+Isolated+from+Solid+Tissues+by+Spectral+Flow+Cytometry.">Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La citometría de flujo multiparamétrico permite el análisis cuantitativo de múltiples tipos de células en un tejido complejo. En este informe, describimos la detección citométrica de flujo de poblaciones mononucleares de fagocitos, incluidos monocitos, células dendríticas y subconjuntos de macrófagos, después de lesiones láser en el ojo del ratón. Liyanage et al recientemente informó de una estrategia de gating similar para detectar neutrófilos, eosinófilos, linfocitos, DCs, macrófagos, macrofagos infilt...

El sistema inmunitario innato incluye múltiples tipos celulares que estimulan la activación y la inflamación del complemento. Las células inmunes innatas incluyen células asesinas naturales (NK), mastocitos, basófilos, eosinófilos, neutrófilos y fagocitos mononucleares. Los fagocitos mononucleares, compuestos por monocitos, macrófagos y células dendríticas, se han implicado en la fisiopatología de múltiples afecciones oftálmicas como la uveítis, la retinopatía diabética y la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE)1. En este protocolo, nos centraremos en la identificación de fagocitos mononucleares utilizando análisis citométricos de flujo multiparamétrico en un modelo de ratón de AMD neovascular2. Este protocolo es adaptable para modelos de ratón de retinopatía diabética y/o uveítis, pero se recomienda una disección ocular más extensa debido a la naturaleza sistémica de estas enfermedades.
Los fagocitos mononucleares expresan marcadores de superficie celular superpuestos. Los macrófagos y microglia residentes en tejidos de larga duración se originan a partir del progenitor eritromicoide derivado del saco de yema3,mientras que el reciclaje de macrófagos y células dendríticas se diferencian del progenitor de células dendríticas de células dendríticas derivadas de la médula ósea4. Los marcadores de superficie de celda del ratón comunes a monocitos, macrófagos y celdas dendríticas incluyen CD45, CD11b5,F4/806,Cx3cr17y el marcador intracelular Iba18. Con el fin de superar este desafío, el análisis transcriptómico de macrófagos, monocitos y células dendríticas de múltiples tejidos define CD64 como un marcador de superficie celular específico del macrófago6. Se han descrito macrófagos en el iris, la coroides, el cuerpo ciliario y el nervio óptico en ojos sanos3. Alternativamente, la identificación de células dendríticas es más difícil; el método más específico de identificación de células dendríticas requiere mapeo del destino utilizando el ratón reportero Zbtb46-GFP9. Independientemente de esta línea de reportero, expresión de CD11c y MHCII en conjunto con la ausencia de CD64 puede identificar posibles células dendríticas6,10. Las células dendríticas se han identificado en córnea, conjuntiva, iris y coroides en los ojos normales11. Las microglias son macrófagos especializados ubicados en la retina, protegidos por la barrera hematoencefálica y derivados de las células progenitoras del saco de yema12. Como resultado, la microglia retiniana se puede diferenciar de los macrófagos derivados de monocitos por sus niveles tenues de la expresión CD4513 y los altos niveles de Tmem119, que está disponible como anticuerpo de citometría de flujo14. Sin embargo, tras la activación de la microglia, el CD45 puede estar regulado15 y Tmem119 puede estar regulado a la baja3,lo que demuestra la complejidad de la biología de la microglia y esto es probablemente relevante tanto en AMD como en su modelo de ratón. Por último, los monocitos se pueden dividir en al menos dos subtipos, incluidos los clásicos y no clásicos. Los monocitos clásicos muestran ccr2+ly6CaltoCX3CR1baja expresión, y los monocitos no clásicos demuestran CCR2-Ly6CbajoCX3CR1 marcadoresaltos 5.
Debido a la necesidad del análisis cuantitativo de la expresión de marcadores, es decir, niveles altos frente a bajos/tenues, la citometría de flujo multiparamétrico es el método ideal para la discriminación entre monocitos, macrófagos, microglia y células dendríticas en el ojo y otros tejidos. Otras ventajas incluyen la identificación de subpoblaciones, la capacidad de utilizar la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para ordenar las poblaciones celulares para el análisis transcriptómico o proteómico, y el mapeo del destino. La principal desventaja de la citometría de flujo multiparametrista es la falta de arquitectura tisular. Esto puede ser superado por la disección oftálmica en los diversos subcompartmentos oculares: córnea, conjuntiva, iris, lente, retina y complejo choroide-sclera. Además, se pueden realizar imágenes confirmatorias de inmunofluorescencia, pero está limitada por el número de marcadores y la falta de cuantificación robusta.
Estudios de asociación del genoma han vinculado múltiples genes complementarios con AMD16. La activación del complemento conduce a la producción de anafiltoxina, el reclutamiento de leucocitos y la inflamación resultante. En ratones deficientes en receptores complementarios, la lesión láser reduce el reclutamiento de fagocitos mononucleares y la neovascularización coroidal inducida por láser (CNV) área17. Del mismo modo, el ratón knockout del receptor de quimiocina con motivo C-C 2 (CCR2), que es deficiente en el reclutamiento de monocitos al tejido, demuestra tanto la disminución del reclutamiento de fagocitos mononucleares como el área18del CNV inducida por láser. Estos enlaces de datos complementan y mononucleares fagocitos con CNV experimental y posiblemente AMD neovascular. En apoyo de esta asociación, los receptores complementarios están disregulados en monocitos sanguíneos periféricos en pacientes con DMM neovascular19,20. Estos datos demuestran una fuerte asociación entre la AMD y los fagocitos mononucleares.
En este manuscrito, utilizaremos el modelo experimental de CNV inducido por láser para caracterizar las poblaciones mononucleares de fagocitos en el ojo del ratón utilizando citometría de flujo multiparametral. El CNV inducido por láser es el modelo estándar de ratón de la AMD neovascular, que demostró la eficacia de la terapia amd neovascular de primera línea actual21. Este protocolo describirá la enucleación de los ojos del ratón, la disección ocular, la digestión en una sola suspensión celular, la tinción de anticuerpos, la determinación de voltajes láser utilizando controles de un solo color y la estrategia de gating utilizando controles de fluorescencia menos uno (FMO). Para obtener una descripción detallada del modelo CNV inducido por láser, consulte la publicaciónanterior 22. Con este protocolo, definiremos microglia, monocitos, células dendríticas y poblaciones de macrófago. Además, utilizaremos MHCII y CD11c para definir aún más subconjuntos de macrófago dentro del modelo CNV inducido por láser.

<table><tbody><tr><td>0.6 ml microcentrifuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>1.7 ml microcentrifuge tubes</td><td>Costar</td><td>3620</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>431031</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conicals</td><td>ThermoFisher</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS, 500 ml</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>2.5 ml syringe</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>7886-1</td><td></td></tr><tr><td>20% paraformaldehyde solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713-S</td><td></td></tr><tr><td>25 ml pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>431032</td><td></td></tr><tr><td>30 G needle</td><td>Exel</td><td>26437</td><td></td></tr><tr><td>3ml luer lock syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955457</td><td></td></tr><tr><td>41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-112</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conicals</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96-well, U-bottom assay plate without lid</td><td>Falcon</td><td>353910</td><td></td></tr><tr><td>Amine reactive beads</td><td>ThermoFisher</td><td>A10628</td><td></td></tr><tr><td>Analysis software</td><td>FlowJo</td><td>v 10</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set</td><td>BD Biosciences</td><td>552845</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Cell counter</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Cell counter slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Compensation beads</td><td>ThermoFisher</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>Count beads</td><td>ThermoFisher</td><td>01-1234-42</td><td></td></tr><tr><td>Curved forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-123</td><td></td></tr><tr><td>Digestion enzyme</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>National Optical and Scientific Instruments, Inc.</td><td>DC3-420T</td><td></td></tr><tr><td>Dissociation tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Electronic dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-937</td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Integra Miltex</td><td>17035X</td><td></td></tr><tr><td>Flow buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow tubes</td><td>Falcon</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Hamster anti-mouse CD11c BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562782</td><td></td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-123</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead dye</td><td>ThermoFisher</td><td>65-0866-14</td><td></td></tr><tr><td>Lysing solution, 10x solution</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Micro titer tube and rack</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-380</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-mouse CD64 PE</td><td>BioLegend</td><td>139304</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562864</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipet tips</td><td>Denville Scientific</td><td>P2404</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipettor</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>P2 pipet tips</td><td>eppendorf</td><td>22491806</td><td></td></tr><tr><td>P2 pipettor</td><td>Gilson</td><td>FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>P20 pipettor</td><td>Gilson</td><td>FA10003M</td><td></td></tr><tr><td>P200 pipet tips</td><td>Denville Scientific</td><td>P2401</td><td></td></tr><tr><td>P200 pipettor</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>Pipet man</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB14955202</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse B220 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562313</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557657</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700</td><td>BD Biosciences</td><td>557958</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD19 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>553786</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD4 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562314</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD45 FITC</td><td>ThermoFisher</td><td>11-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>552848</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD8 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562315</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Ly6C</td><td>BD Biosciences</td><td>561085</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Ly6G PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562700</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700</td><td>BioLegend</td><td>107622</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Siglec F PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562757</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647</td><td>BD Biosciences</td><td>564178</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator</td><td>Labnet</td><td>311DS</td><td></td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Sterile water, 500 ml</td><td>Gibco</td><td>A12873-01</td><td></td></tr><tr><td>Swinging bucket centrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5910 R</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue, 0.4% solution</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

digestion of whole mouse eyes for multi-parameter flow cytometric analysis of mononuclear phagocytes

El sistema inmunitario innato desempeña un papel importante en la fisiopatología ocular, incluida la uveítis, la retinopatía diabética y la degeneración macular relacionada con la edad. Las células inmunes innatas, específicamente fagocitos mononucleares, expresan marcadores de superficie celular superpuestos, lo que hace que identificar estas poblaciones sea un desafío. La citometría de flujo multiparamétrico permite el análisis simultáneo y cuantitativo de múltiples marcadores de superficie celular con el fin de diferenciar monocitos, macrófagos, microglia y células dendríticas en los ojos del ratón. Este protocolo describe la enucleación de ojos enteros del ratón, disección ocular, digestión en una sola suspensión celular y tinción de la suspensión de una sola célula para marcadores de células mieloides. Además, explicamos los métodos adecuados para determinar voltajes utilizando controles de un solo color y para delinear puertas positivas usando fluorescencia menos uno controles. La principal limitación de la citometría de flujo multiparametrista es la ausencia de arquitectura tisular. Esta limitación puede superarse mediante citometría de flujo multiparar de compartimentos oculares individuales o tinción de inmunofluorescencia gratuita. Sin embargo, la inmunofluorescencia está limitada por su falta de análisis cuantitativo y la reducción del número de fluoróforos en la mayoría de los microscopios. Describimos el uso de citometría de flujo multiparamétrico para proporcionar un análisis altamente cuantitativo de fagocitos mononucleares en neovascularización coroidal inducida por láser. Además, la citometría de flujo multiparametrismo se puede utilizar para la identificación de subconjuntos de macrófago, mapeo del destino y clasificación celular para estudios transcriptómicos o proteómicos.

La Figura 1 mostró histogramas de frecuencia no compensados para los SCCs y las celdas para el láser rojo: Alexa647, Alexa700 y APC-Cy7. En la Figura 1A,la línea magenta representaba el pico del SCC para Alexa647, mientras que la línea de cian mostraba la diferencia de registro 0.5 prevista. Observe que el pico en Alexa700 y APC-Cy7 fue a la izquierda (menos brillante) de la línea de cian. También tenga en cuenta que todas las celdas estaban a la izquierda...

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Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

Digestión de ojos enteros del ratón para el análisis citométrico de flujo multiparamétrico de fagocitos mononucleares

Este protocolo proporciona un método para digerir los ojos enteros en una sola suspensión celular con el propósito de análisis citométrico de flujo multiparamétrico con el fin de identificar poblaciones fagocíticas mononucleares oculares específicas, incluyendo monocitos, microglia, macrófagos y células dendríticas.

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

4.9K vistas.  Northwestern University. Este protocolo proporciona un método para digerir los ojos enteros en una sola suspensión celular con el propósito de análisis citométrico de flujo multiparamétrico con el fin de identificar poblaciones fagocíticas mononucleares oculares específicas, incluyendo monocitos, microglia, macrófagos y células dendríticas.

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Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

Ratón enucleación del ojo por remoto de alto rendimiento fenotipificación

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Investigación

Medicina

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

Todo el montaje de la tinción de inmunofluorescencia del Neonatal ratón Retina de investigar Angiogénesis<em&gt; En vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Neurociencias

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and subsequently digests this material, commonly through lysosomal degradation. Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) whose phagocytic function has been described in a broad range of conditions from neurodegenerative disease (e.g., beta-amyloid clearance in Alzheimer&#8217;s disease) to development of the healthy brain (e.g., synaptic pruning)1-6. The following protocol is an engulfment assay developed to visualize and quantify microglia-mediated engulfment of presynaptic inputs in the developing mouse retinogeniculate system7. While this assay was used to assess microglia function in this particular context, a similar approach may be used to assess other phagocytes throughout the brain (e.g., astrocytes) and the rest of the body (e.g., peripheral macrophages) as well as other contexts in which synaptic remodeling occurs (e.g. ,brain injury/disease).

Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) with a high capacity to phagocytose or engulf material in their extracellular environment. Here, a broadly applicable, reliable, and highly quantitative assay for visualizing and measuring microglia-mediated engulfment of synaptic components is described.

Un ensayo de Inmersión en: Un Protocolo para Evaluar Interacciones entre CNS fagocitos y neuronas

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

La evaluación de la función retiniana Microglial fagocítica<em&gt; En Vivo</em&gt; El uso de un ensayo basado en citometría de flujo

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Inmunología e Infección

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main macrophage populations in the CNS: (i) the microglia, which are the resident macrophages of the CNS and are derived from yolk sac progenitors during embryogenesis, and (ii) the monocyte-derived macrophages (MDM), which can infiltrate the CNS during disease and are derived from bone marrow progenitors. The roles of each macrophage subpopulation differ depending on the pathology being studied. Furthermore, there is no consensus on the histological markers or the distinguishing criteria used for these macrophage subpopulations. However, the analysis of the expression profiles of the CD11b and CD45 markers by flow cytometry allows us to distinguish the microglia (CD11b+CD45med) from the MDM (CD11b+CD45high). In this protocol, we show that the density gradient centrifugation and the flow cytometry analysis can be used to characterize these CNS macrophage subpopulations, and to study several markers of interest expressed by these cells as we recently published. Thus, this technique can further our understanding of the role of macrophages in mouse models of neurological diseases and can also be used to evaluate drug effects on these cells.

This protocol provides an analysis of the macrophage subpopulations in the adult mouse central nervous system by flow cytometry and is helpful for the study of multiple markers expressed by these cells.

Análisis de microglia y macrófagos derivados de monocitos del sistema nervioso central por citometría de flujo

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

Cuantificación de la Quimiotaxis de monocitos humanos In Vitro y linfocitos murinos, tráfico en Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

<meta charset="utf8"></head><body>Visualización de pericitos retinianos mediante limpieza de tejidos y marcaje fluorescente

3D Visualization of Retinal Vascular Pericytes in Mice by Immunostaining 

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal vasculature. To provide a detailed view of the morphological characteristics of pericytes, this study described a new approach combining the retro-orbital injection of a fluorescent agent, immunofluorescent-staining, and tissue-clearing treatment. Firstly, the fluorescent tomato lectin was injected into the retro-orbital sinus of the live mouse to label the retinal vasculature. After 5 min, the mouse was sacrificed, and its intact retina was carefully removed from the retinal cup and immunofluorescently stained with platelet-derived growth factor receptor &#946; to reveal the pericytes. Additionally, the stained retina was treated with tissue-clearing reagent and whole mounted on the microscope slide. Through these approaches, the retinal vasculature and pericytes were clearly observed in the transparent retina. Under a confocal microscope, we obtained more opportunities to take high-resolution images for further reconstructing and analyzing the morphological characteristics of pericytes along the retinal vascular tree in a three-dimensional view. Methodologically, this protocol offers an effective approach for visualizing pericytes within the retinal vasculature, providing valuable insights into their role under both physiological and pathological conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Visualización 3D de pericitos vasculares retinianos en ratones mediante inmunotinción

The pericytes in retinal vasculature were examined by immunofluorescent staining with platelet-derived growth factor receptor &#946; after retro-orbital injection of fluorescent tomato lectin. The labeled retina was further treated with the tissue-clearing method and whole mounted for visualizing the three-dimensional views of pericytes surrounding retinal vasculature under a confocal microscope.

Visualización 3D de pericitos vasculares retinianos en ratones mediante inmunotinción 

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal ...

Bioquímica

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Proyección de imagen 3D Time-lapse de la fagocitosis por macrófagos de ratón

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Digestión de ojos enteros del ratón para el análisis citométrico de flujo multiparamétrico de fagocitos mononucleares

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Visualización 3D de pericitos vasculares retinianos en ratones mediante inmunotinción

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Proyección de imagen 3D Time-lapse de la fagocitosis por macrófagos de ratón