JAL, NIH hibesi K08EY030923 tarafından desteklendi; CMC, NIH Ulusal Artrit ve Kas-İskelet Hastalıkları Enstitüsü'nden K01 hibesi (5K01AR060169) ve Lupus Araştırma Birliği'nden Yeni Araştırma Hibesi (637405) ile desteklendi.

Tüm prosedürler Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. C57BL/6 fareleri Northwestern Üniversitesi Karşılaştırmalı Tıp Merkezi'ndeki (Chicago, IL) bir bariyer tesisinde grup tarafından barındırıldı. Tüm hayvanlar, yiyecek ve suya ücretsiz erişim ile 12/12 saat açık / karanlık döngüde barındırıldı.
1. Oküler doku koleksiyonu
<ol><li>Her iki cinsiyette de 10-12 haftalık C57BL/6J fareleri, fare tepkisiz kalana ve artık solunamayana kadar karbondioksitin düzenlenmiş yönetimini kullanarak kurban edin. Ötanaziyi sağlamak için servikal çıkık veya diğer onaylanmış ikincil yöntemi gerçekleştirin. NOT: Oküler dokularda olmayan dolaşımdaki lökositleri çıkarmak için transkardiyal perfüzyon yapılabilir. Bu deneyde, sistemik perfüzyon, tedavi edilmemiş veya lazerle tedavi edilmiş tüm gözlerde tespit edilen mikroglia, monositler, makrofajlar veya dendritik hücrelerin sayısını azaltmaz. Bu nedenle, bu hücre tiplerinin çoğunluğu oftalmik dokularda bulunur ve bu adım isteğe bağlıdır.</li>
	<li>Gözleri enükle etmek için, prizden çıkarken gözün altına hafifçe bir çift kavisli tokmak yerleştirirken göz çukurunun yakınına bastırın. Gerçek gözü sıkmadan gözün altında kapalı olanpsları kıstırın. Gözü çevredeki konjonktivadan sökün (lütfen önceki yayına bakın)23.</li>
	<li>Optik sinir gözü ayırmak için kalan tek bağlantı olana kadar gözü yanal olarak çekin. Optik sinir genellikle gerginlikle kesilir, ancak optik siniri kesmek için bazen küçük bir makas gereklidir. Gözü 1,7 mL mikrosantrifüj tüpünde kalsiyum ve magnezyum ile soğuk 1x Hank'in Tamponlanmış Tuzlu Çözeltisine (HBSS) yerleştirin.</li>
</ol>2. Oküler dokunun sindirimi
<ol><li>Soğuk HBSS'de 0.1 mg/mL sindirim enzimi ve 0.2 mg/mL DNaz içeren sindirim tamponunu hazırlayın. Başlangıçta 2 mL steril suda 5 mg sindirim enzimini yeniden inşa edin. HBSS'de 10 mg/mL DNase ilk seyreltme hazırlayın. Sindirim tamponunun her 10 mL'si için (3 hayvan için yeterli) 9,4 mL soğuk HBSS'yi 0,4 mL yeniden inşa edilmiş sindirim enzimi ve 0,2 mL seyreltilmiş DNase I ile karıştırın. NOT: Bu konsantrasyonlar, hücre ölümünü azaltırken, tek hücrelerin optimal antikor lekeleme seviyelerini sağlamak için birden fazla deneyde ampirik olarak belirlendi. Kollajenaz D, hücre canlılığı azaltılmış ve CD45+ hücreler azalmış sindirim enzimine alternatif olarak denenmiştir. Sindirimi en iyi duruma getirmek için yinelemeli işlemle ilgili daha fazla ayrıntı için lütfen Tartışma'ya bakın.</li>
	<li>10x toplam büyütmede bir diseksiyon mikroskobu altında, soğuk HBSS'de ince tokmaklar ve yay makası kullanarak kalan konjonktivayı ve optik siniri çıkarın.</li>
	<li>Temiz gözleri kuru bir diseksiyon kabına veya küçük bir tartım teknesine taşıyın. Sindirim tamponu çıkışı için gözde görsel eksenden ve bu ilk yaradan 90° uzağa iki delikli yara yapıldıktan sonra vitreus boşluğuna 30 G iğne ile donatılmış şırınga ile 0,15-0,20 mL/göz sindirim tamponu enjekte edin.</li>
	<li>0,5 mm x 0,5 mm'den küçük tüm parçalarla yay makası ve ince askılar kullanarak tüm gözleri kıymalayın. Sonraki adımlarda pipet uçlarının tıkanmasını önlemek için lens dokusunu tokalar aracılığıyla künt mekanik bozulma ile ayrıştırmak. Her numune için, her biri 0,75 mL sindirim tamponu ile forseps ve makası küçük bir tabakta durulayın. Her örnek için yeni bir tabak kullanın.</li>
	<li>Pipet transferinde herhangi bir malzeme kaybetmemeye dikkat ederek P1000 pipet kullanarak yemeğin içeriğini buz üzerindeki bir ayrışma tüpüne aktarın. Yemeği ek 1,5 mL sindirim tamponu ile durulayın ve ayrışma tüpündeki toplam hacmi 3,25-3,50 mL'ye getirin.</li>
	<li>Dissosiyatif tüpü elektronik ayrıştırıcıya ters yerleştirin ve önceden yüklenmiş bir program olan oda sıcaklığında 200 rpm'de 1 dakika tek yönlü rotasyondan oluşan "m_brain_03_01" döngüsünü çalıştırın. Tüm dokunun sindirim tamponu ve bunun için rotor ve kalan tüm adımlarla temas halinde ayrışma tüpünün altında olduğundan emin olun.</li>
	<li>Ayrışma tüpünü 37 °C'de 200 rpm'de 30 dakika boyunca sallama inkübatörüne yerleştirin.</li>
	<li>2.6 ve 2.7. İkinci 30 dk inkübasyondan sonra, adım 2.6'da olduğu gibi elektronik ayrıştırıcı kullanarak son bir mekanik sindirim gerçekleştirin.</li>
	<li>10 mL soğuk akış tamponu ekleyerek reaksiyonu durdurun ve tüpleri buza yerleştirin.</li>
</ol>3. Hücre süspansiyonunun hazırlanması
<ol><li>Tek hücreli süspansiyon oluşturmak için, durdurulan göz sindirim reaksiyonunu 50 mL konik santrifüj tüpünün üstüne yerleştirilmiş 40 μm'lik bir filtreden dökün. Pistonu 2,5 mL şırıngırdan kullanarak, kalan sindirilmemiş göz dokusu parçalarını filtreden geçirin.</li>
	<li>Sindirilmemiş göz dokusu parçalarını filtreden tekrar geçirmek için aynı pistonu kullanmadan önce ayrışma tüpünü 10 mL Akış tamponu ile yıkayın ve filtreyi durulayın.</li>
	<li>5 mL Akış arabelleği kullanarak 3.2 adımını yineleyin.</li>
	<li>Ayrışma tüpünü yıkayın ve son 10 mL Akış tamponu ile filtreleyin. NOT: Toplam sindirim hacmi ve akış tamponu her numune için yaklaşık 38-40 mL'dir.</li>
	<li>Konik tüpü 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj edin. Hücre peletini bozmadan süpernatantı dekant.</li>
	<li>Steril suya 10x lysing çözeltisi ekleyerek 1x lising çözeltisi hazırlayın. Tüpü başka bir tüpe vurarak peletı parçala. Kırmızı kan hücrelerini lyse etmek için, oda sıcaklığında (RT) dönen 30 s için 1 mL 1x lising çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>20 mL Akış arabelleği ile reaksiyonu durdurun.</li>
	<li>Konik tüpü 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj edin. Hücre peletini bozmadan süpernatantı dekant.</li>
	<li>Tüpü başka bir tüpe vurarak peletin ayrıştırın. Tüp başına 5 mL soğuk 1x HBSS ekleyin.</li>
	<li>4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj tüpler. Aspirat süpernatant.</li>
</ol>4. Mononükleer fagositler için hücre süspansiyonunun lekelenerek boyanır
<ol><li>Soğuk HBSS'de Canlı/Ölü boyası 1:5.000 seyrelterek numune başına 0,5 mL Canlı/Ölü lekesi hazırlayın.</li>
	<li>Peletin tamamen ayrıştırmasını sağlamak için bir P1000 pipet kullanarak her numuneye Canlı/Ölü lekesi ekleyin. Numuneleri 1,2 mL mikro titre tüplerine aktarın.</li>
	<li>Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri saymak için küçük bir aliquot (10 μL) alın (bkz. 4.4). Karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca Canlı / Ölü lekeli örnekleri kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Örnek başına canlı hücre sayısını belirlemek için Trypan mavisini kullanarak hücreleri sayın. NOT: Tipik olarak, 10-12 haftalık bir C57BL/6J fareden 2 göz, 2 x 106'dan az canlı hücre içerir.</li>
	<li>Numuneleri 400 μL soğuk Akış tamponu ekleyerek yıkayın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da bir mikro titer tüp rafında santrifüj tüpleri. Hücre peletini bozmadan süpernatantı aspire edin.</li>
	<li>Hücreleri 500 μL soğuk Akış tamponunda tamamen yeniden depolar. 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da bir mikro titer tüp rafında santrifüj tüpleri. Hücre peletini bozmadan süpernatantı aspire edin.</li>
	<li>50 μL Fc bloğunda 5 x10 6 canlı hücreyi bloke edin (saflaştırılmış sıçan fare önleyici CD16/CD32'nin soğuk Akış tamponunda 1:50 seyreltme). 5 x 106'dan fazla canlı hücre varsa, hacimleri uygun şekilde artırın.</li>
	<li>Numuneyi tamamen dağıttığından emin olarak peletin içine Fc bloğu ekleyin. 4 °C'de 20 dakika kuluçkaya yaslanın.</li>
	<li>5 x 10 6 canlı hücre başına doğrudan Fc bloğundaki hücrelere 50 μL antikor boyama çözeltisi ekleyin (çözeltiye dahil edilen her antikorun seçimi ve miktarı için Tablo1'e bakın) ve tamamen karıştırın. 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yaslanın. NOT: Antikor miktarları akış sitometresi konfigürasyona bağlıdır ve her laboratuvar ve cihaz için bağımsız olarak titratlanmalıdır. Filtrelerin ve aynaların cihaz yapılandırması için Tablo 2'ye bakın. Antikorları titratlamak için üreticinin önerisiyle başlayın ve boyama indeksini hesaplayın. Değişen antikor konsantrasyonlarının bir test çalışmasını gerçekleştirin (üreticinin tavsiyesinin hem üstünde hem de altında) ve boyama indeksinin tutulduğu en düşük antikor konsantrasyonu seçin. Ayrıca, tek renk kontrolünden daha az parlak pozitif boyama olduğundan emin olun. Negatif lekeli hücrelerin ölçek üzerinde olduğundan ve 1 x 102'deveya daha az bir tepeye sahip olduğundan emin olmak için lekelenmemiş hücreleri kullanın. Pozitif lekeli hücreleri tanımlamak için floresan eksi bir kontrol kullanın.</li>
	<li>Numuneleri 700 μL soğuk Akış tamponu ekleyerek yıkayın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da bir mikro titer tüp rafında santrifüj tüpleri. Hücre peletini bozmadan süpernatantı aspire edin.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, antikor boyamadan sonra, numuneler Akış tamponunda% 2 paraformaldehitin 500 μL'si ile sabitlenebilir. Numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika sabitlayın. Ardından, 4.10'da açıklandığı gibi bir yıkama gerçekleştirin. Sabit numuneleri 4 °C'de saklayın. Akış sitometrisi veri toplama gününde sayım boncukları eklenmelidir. Sabit numuneler 1-2 gün içinde akış sitometresinde çalıştırılmalıdır. DİkKAT: Paraformaldehit aşındırıcı ve sağlık açısından zararlıdır.</li>
	<li>Numuneleri 500 μL soğuk Akış tamponu kullanarak tekrar yıkayın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da bir mikro titer tüp rafında santrifüj tüpleri. Hücre peletini bozmadan süpernatantın yarısını aspire edin.</li>
	<li>Peletleri yeniden alıp 96 kuyuya, U-bottom test plakasına aktarın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj plakası. Süpernatantı dekante etmek için, plakayı ters çevirin ve güçlü bir sallamada sıvıyı rahatsız edici bir pelet olmadan bir lavabo havzasına yerinden sökün.</li>
	<li>Yeni bir 1,2 mL mikro titre tüpüne, 50 μL iyi girdaplı sayım boncukları yerleştirin.</li>
	<li>Peletleri 200 μL soğuk Akış tamponunda 96 kuyu plakasında yeniden depolar. Önceki adımdan itibaren boncukların üstüne hücre karışımı ekleyin. Toplam 250 μL / mikro titre tüpü hacminde akış sitometresi üzerinde çalıştırın.</li>
</ol>5. Akış sitometrisi verilerinin toplanması
<ol><li>Akış sitometresi açın ve hazırlayın. Burada listelenen talimatlar değiştirilmiş dört lazer sitometresi içindir (Tablo 2).</li>
	<li>Tüm hücrelerin her dedektör için ölçekte olduğundan emin olmak için her örnekten küçük bir aliquot içeren bir test örneği çalıştırın. Voltajları tüm hücrelerin ölçeğinde olacak şekilde ayarlayın.</li>
	<li>Boyama kokteylinde kullanılan her florofor için tek renk kontrolleri (SCC) çalıştırın(Tablo 3). Mikro titre tüpünü akış sitometresi aşamasına yerleştirmek için daha büyük bir 5 mL polistiren tüpe yerleştirin. NOT: BV421 (Pasifik Mavisi), FITC, PE, Alexa647 (APC) ve Alexa700 gibi kök floroforları kokteylle aynı antikoru gerektirmez (örneğin, CD64 PE için CD19 PE). Bununla birlikte, PE-CF594, PE-Cy7 veya APC-Cy7 gibi tandem floroforlar, konjuge floroforların potansiyel ayrışması nedeniyle SCC için kokteyl ile aynı antikoru gerektirir.<ol>
<li>1,2 mL'lik titre tüpüne 2 damla kompanzasyon boncukları ve 1 μL hamster anti-mouse CD11c BV421 ekleyerek BV421 için SCC'yi oluşturun. CD11c BV421, 5.3.3'te açıklandığı gibi kappa yerine bir IgG lambda alt tipi olduğundan kompanzasyon boncukları kullanılır. 4 °C'de 15 dakika kuluçkaya yaslanın. 0,2 mL akış arabelleği ekleyin.</li>
		<li>Amin reaktif boncuklardan bir damla pozitif boyama boncukları (yeşil kapak) ve ardından 1 μL Canlı / Ölü boya ekleyerek Canlı / Ölü boyası için SCC oluşturun. Karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. Amin reaktif boncuklarından negatif boncuklardan (beyaz kapak) bir damla ekleyin. 0,2 mL akış arabelleği ekleyin.</li>
		<li>Anti-sıçan ve anti-hamster Ig kappa boncuk setinden bir damla pozitif boyama boncukları (yeşil kapak) ekleyerek kalan SCC'leri oluşturun, ardından 1,2 mL'lik bir titer tüpünde listelenen antikor miktarı (Tablo 3). 4 °C'de 15 dakika kuluçkaya yaslanın. Anti-sıçan ve anti-hamster Ig kappa boncuk setinden negatif boncuklardan (beyaz kapak) bir damla ekleyin. 0,2 mL akış arabelleği ekleyin.</li>
		<li>Girdap tüm boncuk karışımları tamamen. SCC'leri 4 °C'de 3 güne kadar saklayın. NOT: Floresan muhabir fareler için SCC, tespit edilmemiş hücrelerdir.</li>
		<li>SCC'leri çalıştırırken, SCC örneğinin aynı dedektör kanalındaki bir hücre örneği için herhangi bir floresandan daha yüksek bir tepeye sahip olacak şekilde voltajları ayarlayın. Buna ek olarak, herhangi bir SCC'nin ilgi kanalındaki histogram zirvesi ile diğer kanallar arasında en az 0,5 Log farkı olacak şekilde voltajlar ayarlanmalıdır (Şekil 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Olayları/saniyeyi 4000'in altında tutarak "Düşük" üzerinde örnekler çalıştırın. Akış hızı uygun şekilde düşürülemezse, numuneleri ek soğuk akış tamponu ile seyreltin. Sayım hesaplaması için gerekli olacağından eklenen birimi kaydedin (bkz. temsili sonuçlar).</li>
	<li>Örnek başına en az 3 x 106 olay toplayın. Bu, pigment granülleri ve sitometrenizdeki olaylar olarak sayan döküntüler nedeniyle hücre sayısından daha yüksek olabilir.</li>
	<li>Bölüm 6.4'te uygun gating stratejisi için Live/Dead dışındaki her florofor için bir Floresan Eksi Bir (FMO) kaydedin. FDO, biri hariç tüm floroforlarla boyanmış bir örnektir.</li>
	<li>Akış sitometresini üretici veya tesis talimatlarına göre temizleyin ve kapatın.</li>
</ol>6. Akış sitometrisi verilerinin ek açıklaması
<ol><li>Çözümleme yazılımını kullanarak yeni bir çalışma sayfası açın. Tüm örnekler ve tek renkli kontroller için FCS dosyalarını sitometreden içe aktarın.</li>
	<li>Ücret matrisi oluşturmak için SCC'leri kullanın.</li>
	<li>Kompanzasyon matrisini lekeli örneklerinize ve IPO'larınıza uygulayın.</li>
	<li>Kapıları çizmek için pozitif boyamayı belirlemek için IPO'ları kullanın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+physiology+in+the+eye.">Macrophage physiology in the eye.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).</li><li>Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-Derived+Macrophages+Are+Necessary+for+Beta-Adrenergic+Receptor-Driven+Choroidal+Neovascularization+Inhibition.">Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).</li><li>O'Koren, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Function+Is+Distinct+in+Different+Anatomical+Locations+during+Retinal+Homeostasis+and+Degeneration.">Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration.</a> Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).</li><li>Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+Conversion+During+Inflammation+and+Injury.">Monocyte Conversion During Inflammation and Injury.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).</li><li>Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+monocytes+and+macrophages+for+the+inflammatory+response+in+acute+liver+injury.">Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury.</a> Frontiers in Physiology. 3, 56 (2012).</li><li>Gautier, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiles+and+transcriptional+regulatory+pathways+that+underlie+the+identity+and+diversity+of+mouse+tissue+macrophages.">Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.</a> Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).</li><li>Sutti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1+Mediates+the+Development+of+Monocyte-Derived+Dendritic+Cells+during+Hepatic+Inflammation.">CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation.</a> Cells. 8 (9), 1099 (2019).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+Cells+Expressing+VEGF+and+Arginase-1+Following+Uptake+of+Damaged+Retinal+Pigment+Epithelium+Suggests+Potential+Mechanism+That+Drives+the+Onset+of+Choroidal+Angiogenesis+in+Mice.">Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice.</a> PLoS One. 8 (8), 72935 (2013).</li><li>Satpathy, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zbtb46+expression+distinguishes+classical+dendritic+cells+and+their+committed+progenitors+from+other+immune+lineages.">Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).</li><li>Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-Production+by+CCR2-Dependent+Macrophages+Contributes+to+Laser-Induced+Choroidal+Neovascularization.">VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization.</a> PLoS One. 9 (4), 94313 (2014).</li><li>Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ocular+dendritic+cells+in+uveitis.">The role of ocular dendritic cells in uveitis.</a> Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).</li><li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny,+activation+and+function.">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li><li>O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+reveals+that+microglia+and+recruited+monocyte-derived+macrophages+are+definitively+distinguishable+by+phenotype+in+the+retina.">Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina.</a> Science Reports. 6, 20636 (2016).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li><li>M&#252;ller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., M&#252;ller, S., Vajkoczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+microglia,+and+not+peripheral+macrophages,+are+the+main+source+of+brain+tumor+mononuclear+cells.">Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells.</a> International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).</li><li>McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration+and+the+role+of+the+complement+system.">Age-related macular degeneration and the role of the complement system.</a> Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).</li><li>Nozaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+complement+components+C3a+and+C5a+promote+choroidal+neovascularization.">Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).</li><li>Tsutsumi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+critical+role+of+ocular-infiltrating+macrophages+in+the+development+of+choroidal+neovascularization.">The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization.</a> Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).</li><li>Subhi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+CD11b++Monocytes+and+Anti&#8211;Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Injections+in+Treatment+of+Neovascular+Age-Related+Macular+Degeneration+and+Polypoidal+Choroidal+Vasculopathy.">Association of CD11b +Monocytes and Anti&#8211;Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy.</a> JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).</li><li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Expression+of+CD46+and+CD59+on+Leukocytes+in+Neovascular+Age-Related+Macular+Degeneration.">Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration.</a> AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).</li><li>Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+is+major+stimulator+in+model+of+choroidal+neovascularization.">VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).</li><li>Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+for+Laser-induced+Choroidal+Neovascularization.">A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).</li><li>Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Eye+Enucleation+for+Remote+High-throughput+Phenotyping.">Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3814 (2011).</li><li>Makinde, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Microglia-Specific+Transcriptional+Signature+Correlates+with+Behavioral+Deficits+in+Neuropsychiatric+Lupus.">A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus.</a> Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).</li><li>Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+depletion+inhibits+experimental+choroidal+neovascularization.">Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).</li><li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization:+nomenclature+and+experimental+guidelines.">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li><li>Liyanage, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+inflammatory+and+resident+myeloid+populations+in+mouse+ocular+inflammatory+models.">Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models.</a> Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).</li><li>Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cell+Suspensions+Isolated+from+Solid+Tissues+by+Spectral+Flow+Cytometry.">Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Çok parametreli akış sitometrisi, karmaşık bir dokudaki birden fazla hücre tipinin nicel analizini sağlar. Bu raporda, fare gözünde lazer yaralanmasından sonra monositler, dendritik hücreler ve makrofaj alt kümeleri de dahil olmak üzere mononükleer fagosit popülasyonlarının akış sitometrik tespitini açıklıyoruz. Liyanage ve arkadaşları son zamanlarda nötrofilleri, eozinofilleri, lenfositleri, DC'leri, makrofajları, sızan makrofajları ve monositleri tespit etmek için benzer bir gating strateji...

Doğuştan gelen bağışıklık sistemi, kompleman aktivasyonunu ve iltihabı uyaran birden fazla hücre tipi içerir. Doğuştan gelen bağışıklık hücreleri arasında doğal öldürücü (NK) hücreler, mast hücreleri, bazofiller, eozinofiller, nötrofiller ve mononükleer fagositler bulunur. Monositler, makrofajlar ve dendritik hücrelerden oluşan mononükleer fagositler, üveit, diyabetik retinopati ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) dahil olmak üzere birden fazla oftalmik durum patofizyolojisinde yer1. Bu protokolde, neovasküler AMD2'ninbir fare modelinde çok parametreli akış sitometrik analizi kullanarak mononükleer fagositlerin tanımlanmasına odaklanacağız. Bu protokol diyabetik retinopati ve/veya üveit fare modelleri için uyarlanabilir, ancak bu hastalıkların sistemik doğası nedeniyle daha kapsamlı oküler diseksiyon önerilir.
Mononükleer fagositler çakışan hücre yüzeyi işaretleyicilerini ifade eder. Uzun ömürlü doku yerleşik makrofajlar ve mikroglia yumurta sarısı kese türevi eritromileoid progenitor3'ten kaynaklanırken, makrofajların ve dendritik hücrelerin geri dönüşümü kemik iliği türevi makrofaj dendritik hücre progenitor4'tenfarklıdır. Monositler, makrofajlar ve dendritik hücrelerde ortak olan fare hücresi yüzey işaretçileri CD45, CD11b5, F4/806, Cx3cr17ve hücre içi işaretleyici Iba18 'iiçerir. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, birden fazla dokudan gelen makrofajların, monositlerin ve dendritik hücrelerin transkriptomik analizi CD64'ü makrofaja özgü bir hücre yüzeyi işaretleyicisi olarak tanımlar6. Makrofajlar sağlıklı gözlerde iris, koroid, silier vücut ve optik sinirde tanımlanmıştır3. Alternatif olarak, dendritik hücre tanımlaması daha zordur; dendritik hücre tanımlamanın en özel yöntemi, Zbtb46-GFP muhabirfaresi 9kullanılarak kader eşlemesi gerektirir. Bu muhabir satırından bağımsız olarak, CD64 yokluğu ile birlikte CD11c ve MHCII ifadesi potansiyel dendritik hücreleritanımlayabilir 6,10. Normal gözlerde kornea, konjonktiva, iris ve koroidde dendritik hücreler tanımlanmıştır11. Mikroglia retinada bulunan, kan-retina bariyeri ile korunan ve yumurta sarısı kesesi progenitör hücrelerinden elde edilen özel makrofajlardır12. Sonuç olarak, retinal mikroglia monosit türevi makrofajlardan CD45 ekspresyon13 loş seviyeleri ve akış sitomemetri antikoru 14 olarak kullanılabilen yüksek Tmem119 seviyeleri ile ayırt edilebilir. Bununla birlikte, mikroglia aktivasyonu üzerine, CD45 yukarı regüle edilebilir15 ve Tmem119 aşağı düzenlenmiş olabilir3Mikroglia biyolojisinin karmaşıklığını gösteren ve bu muhtemelen hem AMD hem de fare modelinde geçerlidir. Son olarak, monositler klasik ve klasik olmayan dahil olmak üzere en az iki alt tipe ayrılabilir. Klasik monositler CCR2+Ly6CyüksekCX3CR1düşük ifadesini gösterir ve klasik olmayan monositler CCR2-Ly6CdüşükCX3CR1yüksek işaretleyicilerigösterir 5.
İşaretçi ekspresyonunun nicel analizinin gerekliliği nedeniyle, yani yüksek ve düşük/loş seviyeler, çok parametreli akış sitometrisi, göz ve diğer dokulardaki monositler, makrofajlar, mikroglia ve dendritik hücreler arasında ayrımcılık için ideal bir yöntemdir. Ek avantajlar arasında alt popülasyonların tanımlanması, hücre popülasyonlarını transkriptomik veya proteomik analiz için sıralamak için floresanla etkinleştirilen hücre sıralamasını (FACS) kullanma yeteneği ve kader haritalaması saydır. Çok parametreli akış sitometrisinin en büyük dezavantajı doku mimarisinin olmamasıdır. Bu, oftalmik diseksiyonun çeşitli oküler alt bölümlere girmesiyle aşılabilir: kornea, konjonktiva, iris, lens, retina ve koroid-sklera kompleksi. Ek olarak, doğrulayıcı immünofluoresans görüntüleme yapılabilir, ancak belirteç sayısı ve sağlam miktar eksikliği ile sınırlıdır.
Genom geniş ilişki çalışmaları AMD16ile birden fazla tamamlayıcı gen bağlamaktadır. Kompleman aktivasyonu anafilatoksin üretimine, lökosit alımına ve ortaya çıkan iltihaplanmaya yol açar. Kompleman reseptör eksikliği olan farelerde lazer yaralanması mononükleer fagosit alımını ve lazer kaynaklı koroidal neovaskülarizasyon (CNV) alanını azaltır17. Benzer şekilde, dokuya monosit alımında eksik olan C-C motifli kemokin reseptörü 2 (CCR2) nakavt faresi, hem mononükleer fagosit alımının azaldığını hem de lazer kaynaklı CNV alanı18. Bu veri bağlantısı, deneysel CNV ve muhtemelen neovasküler AMD ile mononükleer fagositleri tamamlar ve tamamlar. Bu ilişkiyi desteklemek için, kompleman reseptörleri neovasküler AMD19,20olan hastalarda periferik kan monositleri üzerinde disregüle edilir. Bu veriler AMD ve mononükleer fagositler arasında güçlü bir ilişki olduğunu göstermektedir.
Bu yazıda, çok parametreli akış sitometrisi kullanarak fare gözündeki mononükleer fagosit popülasyonlarını karakterize etmek için deneysel lazer kaynaklı CNV modelini kullanacağız. Lazer kaynaklı CNV, mevcut ilk hat neovasküler AMD tedavisinin etkinliğini gösteren neovasküler AMD'nin standart fare modelidir21. Bu protokol, fare gözlerinin enükleasyonunu, oküler diseksiyonu, tek hücreli süspansiyona sindirimi, antikor boyama, tek renk kontrolleri kullanılarak lazer voltajlarının belirlenmesi ve floresan eksi bir (FMO) kontrolleri kullanılarak gating stratejisini tanımlayacaktır. Lazer kaynaklı CNV modelinin ayrıntılı bir açıklaması için lütfen önceki bir yayına bakın22. Bu protokolü kullanarak mikroglia, monositler, dendritik hücreler ve makrofaj popülasyonlarını tanımlayacağız. Ayrıca, lazer kaynaklı CNV modeli içinde makrofaj alt kümelerini daha fazla tanımlamak için MHCII ve CD11c'yi kullanacağız.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.6 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>431031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conicals</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x HBSS, 500 ml</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 ml syringe</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>7886-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% paraformaldehyde solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>431032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needle</td>
			<td>Exel</td>
			<td>26437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3ml luer lock syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-732-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conicals</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well, U-bottom assay plate without lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine reactive beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td>v 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compensation beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>01-1111-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Count beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>01-1234-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion enzyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>National Optical and Scientific Instruments, Inc.</td>
			<td>DC3-420T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Diva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>17035X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamster anti-mouse CD11c BV421</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-210-123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing solution, 10x solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro titer tube and rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse CD64 PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>139304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipet tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P2404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 pipet tips</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22491806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10003M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipet tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet man</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB14955202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse B220 PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD19 PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD4 PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD45 FITC</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD8 PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ly6C</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ly6G PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>107622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Siglec F PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>311DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water, 500 ml</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A12873-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging bucket centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5910 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue, 0.4% solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digestion of whole mouse eyes for multi-parameter flow cytometric analysis of mononuclear phagocytes

Doğuştan gelen bağışıklık sistemi üveit, diyabetik retinopati ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu dahil olmak üzere oküler patofizyolojide önemli roller oynar. Doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, özellikle mononükleer fagositler, üst üste binen hücre yüzey belirteçlerini ifade eder, bu da bu popülasyonları tanımlamayı zorlaştırır. Çok parametreli akış sitometrisi, fare gözlerindeki monositleri, makrofajları, mikrogliaları ve dendritik hücreleri ayırt etmek için birden fazla hücre yüzey belirtecinin eşzamanlı, nicel analizine izin verir. Bu protokol, tüm fare gözlerinin enükleasyonunu, oküler diseksiyonu, tek bir hücre süspansiyonuna sindirimi ve miyeloid hücre belirteçleri için tek hücre süspansiyonunun lekelenmesini açıklar. Ek olarak, tek renk kontrolleri kullanarak voltajları belirlemek ve floresan eksi bir kontrol kullanarak pozitif kapıların sınırlandırması için uygun yöntemleri açıklıyoruz. Çok parametreli akış sitometrisinin en önemli sınırlaması doku mimarisinin olmamasıdır. Bu sınırlama, bireysel oküler bölmelerin çok parametreli akış sitometrisi veya ücretsiz immünoresans lekeleme ile aşılabilir. Bununla birlikte, immünofluoresans, nicel analiz eksikliği ve çoğu mikroskopta florofor sayısının azalması ile sınırlıdır. Lazer kaynaklı koroidal neovaskülarizasyonda mononükleer fagositlerin yüksek nicel analizini sağlamak için multi-parametrik akış sitometrisinin kullanımını açıklıyoruz. Ayrıca, çok parametreli akış sitometrisi, transkriptomik veya proteomik çalışmalar için makrofaj alt kümelerinin tanımlanması, kader haritalaması ve hücre sıralama için kullanılabilir.

Şekil 1, SCC'ler ve kırmızı lazer hücreleri için telafi edilmemiş frekans histogramları gösterdi: Alexa647, Alexa700 ve APC-Cy7. Şekil 1A'da,macenta çizgisi Alexa647 için SCC'nin zirvesini gösterirken, camgöbeği çizgisi hedeflenen 0,5 Günlük farkını göstermiştir. Alexa700 ve APC-Cy7'deki tepe noktasının siyan hattının solunda (daha az parlak) olduğuna dikkat edin. Ayrıca, hücrelerin hepsinin macenta çizgisinin solunda olduğunu unut...

Watch this Scientific Journal Video about Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes at JoVE.com

Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

Mononükleer Fagositlerin Çok Parametreli Akış Sitometrik Analizi için Tüm Fare Gözlerinin Sindirimi

Bu protokol, monositler, mikroglia, makrofajlar ve dendritik hücreler de dahil olmak üzere belirli oküler mononükleer fagositik popülasyonları tanımlamak için çok parametreli akış sitometrik analizi amacıyla tüm gözleri tek bir hücre süspansiyonuna sindirmek için bir yöntem sağlar.

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. ...

digestion-whole-mouse-eyes-for-multi-parameter-flow-cytometric

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

4.8K Görüntüleme.  Northwestern University. Bu protokol, monositler, mikroglia, makrofajlar ve dendritik hücreler de dahil olmak üzere belirli oküler mononükleer fagositik popülasyonları tanımlamak için çok parametreli akış sitometrik analizi amacıyla tüm gözleri tek bir hücre süspansiyonuna sindirmek için bir yöntem sağlar.

Video: Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Nanopartikül Aşılama sonrası analizi antijene özgü CD8 + T hücresi tepkileri için tüm hayvan Görüntüleme ve Akış Sitometrisi Teknikleri

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

İskemik Fare Beyin gelen Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 malignant gliomas soon after intracranial engraftment if the cancer cells are rendered deficient in their expression of the &#946;-galactoside-binding lectin galectin-1 (gal-1). More recent work now shows that a population of Gr-1+/CD11b+ myeloid cells is critical to this effect. To better understand the mechanisms by which NK and myeloid cells cooperate to confer gal-1-deficient tumor rejection we have developed a comprehensive protocol for the isolation and analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The method is demonstrated here by comparing PBMC infiltration into the tumor microenvironment of gal-1-expressing GL26 gliomas with those rendered gal-1-deficient via shRNA knockdown. The protocol begins with a description of&#160;how to culture and prepare GL26 cells for inoculation into the syngeneic C57BL/6J mouse brain. It then explains the steps involved in the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs from the early brain tumor microenvironment. The method is adaptable to a number of in vivo experimental designs in which temporal data on immune infiltration into the brain is required. The method is sensitive and highly reproducible, as glioma-infiltrating PBMCs can be isolated from intracranial tumors as soon as 24 hr post-tumor engraftment with similar cell counts observed from time point matched tumors throughout independent experiments. A single experimentalist can perform the method from brain harvesting to flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs in roughly 4-6 hr depending on the number of samples to be analyzed. Alternative glioma models and/or cell-specific detection antibodies may also be used at the experimentalists&#8217; discretion to assess the infiltration of several other immune cell types of interest without the need for alterations to the overall procedure.

Presented here is a straightforward method for the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells that yields time-dependent quantitative data on the number and activation status of immune cells entering the early brain tumor microenvironment.

İzolasyon ve Glioma-sızmakta periferik kan mononükleer hücrelerinin Akışı Sitometrik Analizi

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Fare Küçük Bağırsak Lenfositler izolasyonu ve Akım Sitometrisi Karakterizasyonu

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of monocytes induces effector functions and a concomitant shift from oxidative to glycolytic metabolism that is accompanied by increased glucose transporter expression. This increased glycolytic metabolism is also observed for trained immunity of monocytes, a form of innate immunological memory. Although in vitro protocols examining glucose transporter expression and glucose uptake by monocytes have been described, none have been examined by multi-parametric flow cytometry in whole blood. We describe a multi-parametric flow cytometric protocol for the measurement of fluorescent glucose analog 2-NBDG uptake in whole blood by total monocytes and the classical (CD14++CD16-), intermediate (CD14++CD16+) and non-classical (CD14+CD16++) monocyte subpopulations. This method can be used to examine glucose transporter expression and glucose uptake for total monocytes and monocyte subpopulations during homeostasis and inflammatory disease, and can be easily modified to examine glucose uptake for other leukocytes and leukocyte subpopulations within blood.

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

Basit Akım Sitometrisi Yöntemi Tüm Kan Monosit subpopulations için glikoz alımını ve Glikoz Transporter Anlatım Tedbir

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

PM10 parçacık bağlı Bet v 1 Allergen Akışı Sitometrik Analizi

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

İnsan Endoservikal Gamma Delta T Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

İnsan monosit alt kümeleri tam kan tarafından karakterizasyonu Akış Sitometresi Analizi

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

Lenfatik endotel hücreleri akış sitometrik çözümlenmesi için fare karaciğer sindirim

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...