JAL wurde durch den NIH-Zuschuss K08EY030923 unterstützt; CMC wurde durch ein K01-Stipendium (5K01AR060169) des NIH National Institute of Arthritis and Musculoskeletal Diseases und ein Novel Research Grant (637405) der Lupus Research Alliance unterstützt.

Alle Verfahren wurden vom Northwestern University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. C57BL/6-Mäuse wurden in einer Barriereanlage am Center for Comparative Medicine der Northwestern University (Chicago, IL) untergebracht. Alle Tiere wurden in 12/12 h Licht/Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht.
1. Sammlung von Augengewebe
<ol><li>Opfern Sie 10-12-Wochen-alte C57BL/6J-Mäuse beiderlei Geschlechts mit regulierter Verabreichung von Kohlendioxid, bis die Maus nicht mehr reagiert und nicht mehr einatmet. Führen Sie Zervixdislokation oder eine andere zugelassene sekundäre Methode durch, um Dieeuthanasie zu gewährleisten. HINWEIS: Transkardiale Perfusion kann durchgeführt werden, um zirkulierende Leukozyten zu entfernen, die sich nicht in den Augengeweben befinden. In diesem Experiment reduziert die systemische Perfusion nicht die Anzahl von Mikroglia, Monozyten, Makrophagen oder dendritischen Zellen, die in unbehandelten oder laserbehandelten ganzen Augen nachgewiesen werden. Daher befinden sich die meisten dieser Zelltypen im ophthalmologischen Gewebe und dieser Schritt ist optional.</li>
	<li>Um die Augen zu enukleieren, drücken Sie in der Nähe der Augenhöhle nach unten, während Sie ein Paar gekrümmte Zangen sanft unter das Auge legen, während es aus der Steckdose herausragt. Pinch Zange unter dem Auge geschlossen, ohne das eigentliche Auge zu drücken. Augen aus der umgebenden Bindehaut lösen (siehe vorherige Veröffentlichung)23.</li>
	<li>Ziehen Sie das Auge seitlich, bis der Sehnerv die einzige verbleibende Verbindung ist, um das Auge zu lösen. Der Sehnerv trennt sich oft mit Spannung, aber manchmal ist eine kleine Schere notwendig, um den Sehnerv zu schneiden. Legen Sie das Auge in kalte 1x Hank es Buffered Saline Solution (HBSS) mit Kalzium und Magnesium in 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr.</li>
</ol>2. Verdauung des Augengewebes
<ol><li>Bereiten Sie den Verdauungspuffer vor, der 0,1 mg/ml Verdauungsenzym und 0,2 mg/ml DNase in kalten HBSS enthält. Rekonstituieren Sie zunächst 5 mg Verdauungsenzym in 2 ml sterilem Wasser. Bereiten Sie eine anfängliche Verdünnung von 10 mg/ml DNase in HBSS vor. Pro 10 ml des Verdauungspuffers (ausreichend für 3 Tiere) 9,4 ml kalteHBSS mit 0,4 ml rekonstituiertem Verdauungsenzym und 0,2 ml verdünnter DNase I mischen. HINWEIS: Diese Konzentrationen wurden empirisch über mehrere Experimente bestimmt, um ein optimales Maß an Antikörperfärbung einzelner Zellen zu ermöglichen und gleichzeitig den Zelltod zu reduzieren. Collagenase D wurde als Alternative zum Verdauungsenzym mit reduzierter Zelllebensfähigkeit und verminderter CD45+ Zellen ausprobiert. Weitere Informationen zum iterativen Prozess zur Optimierung der Verdauung finden Sie in der Diskussion.</li>
	<li>Entfernen Sie unter einem Sezierender Mikroskop bei 10-facher Gesamtvergrößerung die verbleibende Bindehaut und den Sehnerv mit feinen Zangen und Federscheren in kalten HBSS.</li>
	<li>Bewegen Sie saubere Augen zu einer trockenen Sezschale oder einem kleinen Wägeboot. Injizieren Sie 0,15-0,20 ml/Auge des Verdauungspuffers über eine Spritze mit 30 G Nadel in die Glaskörperhöhle, nachdem zwei perforierende Wunden im Auge durch die Sehachse und 90° von dieser ersten Wunde entfernt für den Verdauungspufferausgang gemacht wurden.</li>
	<li>Mit Federschere und feinen Zangen mit allen Teilen kleiner als 0,5 mm x 0,5 mm ganze Augen zerkleinern. Dissoziieren Sie Linsengewebe mit stumpfer mechanischer Störung über Zangen, um das Verstopfen von Pipettenspitzen in nachfolgenden Schritten zu verhindern. Für jede Probe, Spülen Zangen und Schere jeweils mit 0,75 ml Verdauungspuffer in kleine Schale. Verwenden Sie für jede Probe ein neues Gericht.</li>
	<li>Übertragen Sie den Inhalt der Schale auf ein Dissoziationsrohr auf Eis mit P1000 Pipette, wobei darauf geachtet wird, dass kein Material in der Pipettenübertragung verloren geht. Spülen Sie die Schale mit zusätzlichen 1,5 ml Verdauungspuffer, wodurch das Gesamtvolumen in Dissoziationsrohr auf 3,25-3,50 ml.</li>
	<li>Legen Sie das Dissoziationsrohr invertiert auf den elektronischen Dissoziator und laufen Sie den Zyklus "m_brain_03_01", bestehend aus 1 min unidirektionaler Drehung bei 200 U/min bei Raumtemperatur, was ein vorinstalliertes Programm ist. Stellen Sie sicher, dass sich das gesamte Gewebe an der Unterseite des Dissoziationsrohrs in Kontakt mit dem Verdauungspuffer und dem Rotor für diesen und alle verbleibenden Schritte befindet.</li>
	<li>Legen Sie das Dissoziationsrohr in den Schüttelinkubator für 30 min bei 200 U/min bei 37 °C.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.6 und 2.7 ein weiteres Mal. Nach der zweiten 30 min Inkubation führen Sie eine letzte mechanische Verdauung mit elektronischem Dissoziator wie in Schritt 2.6 durch.</li>
	<li>Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 10 ml Kaltstrompuffer hinzufügen und Rohre auf Eis legen.</li>
</ol>3. Vorbereitung der Zellsuspension
<ol><li>Um eine einzellige Suspension zu erzeugen, gießen Sie die angehaltene Augenverdauungsreaktion durch einen 40-m-Filter, der auf der Oberseite eines 50 ml konischen Zentrifugenrohrs platziert wird. Mit dem Kolben aus einer 2,5 ml Spritze schieben Sie alle verbleibenden Teile des unverdauten Augengewebes durch den Filter.</li>
	<li>Waschen Sie das Dissoziationsrohr mit 10 ml Flow-Puffer und Spülfilter, bevor Sie den gleichen Kolben verwenden, um wieder unverdaute Augengewebeteile durch den Filter zu leiten.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 3.2 mit 5 ml Flow-Puffer.</li>
	<li>Waschen Sie das Dissoziationsrohr und den Filter mit einem endgültigen 10 ml Flow-Puffer. HINWEIS: Das Gesamtvolumen des Verdauungs- und Durchflusspuffers beträgt etwa 38-40 ml pro Probe.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das konische Rohr bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Dekant den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.</li>
	<li>Bereiten Sie 1x Lysing-Lösung vor, indem Sie sterilem Wasser eine 10-fache Lysing-Lösung hinzufügen. Brechen Sie das Pellet auf, indem Sie das Rohr gegen ein anderes Rohr streicheln. Um rote Blutkörperchen zu lysieren, fügen Sie 1 ml 1x Lysing-Lösung für 30 s mit Wirbeln bei Raumtemperatur (RT).</li>
	<li>Stoppen Sie die Reaktion mit 20 ml Flow-Puffer.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das konische Rohr bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Dekant den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.</li>
	<li>Dissoziieren Sie das Pellet, indem Sie das Rohr gegen ein anderes Rohr streicheln. Fügen Sie 5 ml kalte 1x HBSS pro Tube hinzu.</li>
	<li>Zentrifugenrohre bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Aspirat Überstand.</li>
</ol>4. Färbung der Zellsuspension für mononukleäre Phagozyten
<ol><li>Bereiten Sie 0,5 ml Lebend/Totfleck pro Probe vor, indem Sie Live/Dead Farbstoff 1:5.000 in kalten HBSS verdünnen.</li>
	<li>Fügen Sie jeder Probe mit einer P1000 Pipette einen Live/Dead-Fleck hinzu, der sich erstellt, um das Pellet vollständig zu trennen. Proben in 1,2 ml Mikrotiterröhren übertragen.</li>
	<li>Nehmen Sie einen kleinen Aliquot (10 L), um Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler zu zählen (siehe 4.4). Inkubieren Sie Proben mit Live/Dead-Färbung für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.</li>
	<li>Zählen Sie Zellen mit Trypan blue, um die Anzahl der lebenden Zellen pro Probe zu bestimmen. HINWEIS: In der Regel enthalten 2 Augen einer 10-12 Wochen alten C57BL/6J-Maus weniger als 2 x 106 lebende Zellen.</li>
	<li>Waschen Sie Proben, indem Sie 400 l kalten Durchflusspuffer hinzufügen. Zentrifugenrohre in einem Mikrotiterrohrgestell bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.</li>
	<li>Resuspend Zellen vollständig in 500 l kalten Flow-Puffer. Zentrifugenrohre in einem Mikrotiterrohrgestell bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.</li>
	<li>Blockieren Sie bis zu 5 x 106 lebende Zellen in 50 l Fc Block (1:50 Verdünnung im kalten Durchflusspuffer der gereinigten Rattenanti-Maus-CD16/CD32). Wenn mehr als 5 x 106 lebende Zellen, erhöhen Volumen angemessen.</li>
	<li>Fügen Sie dem Pellet einen Fc-Block hinzu, um sicherzustellen, dass die Probe vollständig getrennt wird. 20 min bei 4 °C inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 50 l Antikörper-Färbelösung (siehe Tabelle 1 zur Auswahl und Menge jedes Antikörpers, der in der Lösung enthalten ist) pro 5 x 106 lebenden Zellen direkt zu den Zellen in Fc Block hinzufügen und vollständig mischen. 30 min bei 4 °C inkubieren. HINWEIS: Antikörpermengen sind abhängig von der Durchflusszytometerkonfiguration und sollten für jedes Labor und Instrument unabhängig getitriert werden. Siehe Tabelle 2 für die Instrumentenkonfiguration von Filtern und Spiegeln. Um Antikörper zu tittieren, beginnen Sie mit der Empfehlung des Herstellers und berechnen Sie den Färbeindex. Führen Sie einen Testlauf mit unterschiedlichen Antikörperkonzentrationen (sowohl oberhalb als auch unterhalb der Empfehlung des Herstellers) durch und wählen Sie die niedrigste Antikörperkonzentration, bei der der Färbeindex beibehalten wird. Stellen Sie außerdem sicher, dass die positive Färbung weniger hell ist als die einfarbige Steuerung. Verwenden Sie ungefärbte Zellen, um sicherzustellen, dass negativ gefärbte Zellen auf einer Skala sind und einen Spitzenwert von 1 x 102haben. Verwenden Sie eine Fluoreszenz minus ein Steuerelement, um die positiv gefärbten Zellen zu definieren.</li>
	<li>Waschen Sie Proben, indem Sie 700 l kalten Durchflusspuffer hinzufügen. Zentrifugenrohre in einem Mikrotiterrohrgestell bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.</li>
	<li>Optional können die Proben nach der Antikörperfärbung mit 500 l Paraformaldehyd im Durchflusspuffer fixiert werden. Proben für 15 min bei Raumtemperatur fixieren. Führen Sie dann eine Wäsche durch, wie in 4.10 beschrieben. Feste Proben bei 4 °C lagern. Zählperlen sollten am Tag der Datenerfassung der Durchflusszytometrie hinzugefügt werden. Feste Proben sollten auf durchflusszytometer in 1-2 Tagen laufen. VORSICHT: Paraformaldehyd ist ein korrosives und gesundheitsgefährdendes Mittel.</li>
	<li>Waschen Sie die Proben erneut mit 500 l kaltem Durchflusspuffer. Zentrifugenrohre in einem Mikrotiterrohrgestell bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Die Hälfte des Überstandes aspirieren, ohne das Zellpellet zu stören.</li>
	<li>Pellets aufsetzen und auf eine 96-Gut,U-Boden-Assayplatte übertragen. Zentrifugenplatte bei 400 x g für 5 min bei 4 °C. Um den Überstand zu dekantatigen, drehen Sie die Platte um und in einem starken Shake lösen Sie die Flüssigkeit in ein Waschbecken, ohne Pellet zu stören.</li>
	<li>In einem neuen 1,2 ml Mikrotiterrohr 50 l gut wirbelnde Zählperlen platzieren.</li>
	<li>Pellets in 96 Brunnenplatten in 200 l Kaltflusspuffer resuspendieren. Fügen Sie Zellmischung auf der Oberseite der Perlen aus dem vorherigen Schritt. Laufen Sie auf Durchflusszytometer in einem Gesamtvolumen von 250 L / Mikro-Titer-Rohr.</li>
</ol>5. Erfassung von Flusszytometriedaten
<ol><li>Schalten Sie das Durchflusszytometer ein und bereiten Sie es vor. Hier aufgeführte Anweisungen sind für ein modifiziertes Vierlaserzytometer (Tabelle 2).</li>
	<li>Führen Sie eine Testprobe aus, die einen kleinen Aliquot aus jeder Probe enthält, um sicherzustellen, dass alle Zellen für jeden Detektor skaliert werden. Passen Sie die Spannungen so an, dass alle Zellen skaliert sind.</li>
	<li>Führen Sie Single Color Controls (SCC) für jedes Fluorophor aus, das in Derfärbecocktails verwendet wird (Tabelle 3). Legen Sie Mikrotiterrohr in ein größeres 5 ml Polystyrolrohr für die Platzierung auf der Durchflusszytometer-Stufe. HINWEIS: Wurzelfluorophore wie BV421 (Pacific Blue), FITC, PE, Alexa647 (APC) und Alexa700 benötigen nicht den gleichen Antikörper wie der Cocktail (d. h. CD19 PE für CD64 PE). Tandem-Fluorophore wie PE-CF594, PE-Cy7 oder APC-Cy7 benötigen jedoch aufgrund einer möglichen Dissoziation der konjugierten Fluorophore denselben Antikörper für SCC wie Cocktail.<ol>
<li>Erstellen Sie den SCC für BV421, indem Sie 2 Tropfen Kompensationsperlen zu einem 1,2 ml Titerrohr zusammen mit 1 L Hamster-Anti-Maus-CD11c BV421 hinzufügen. Kompensationsperlen werden verwendet, da CD11c BV421 ein IgG-Lambda-Subtyp und nicht Kappa ist, wie in 5.3.3 beschrieben. 15 Min. bei 4 °C inkubieren. Fügen Sie 0,2 ml Durchflusspuffer hinzu.</li>
		<li>Erstellen Sie den SCC für den Live/Dead Farbstoff, indem Sie einen Tropfen positiver Färbeperlen (grüne Kappe) aus den amin-reaktiven Perlen hinzufügen, gefolgt von 1 L Live/Dead Farbstoff. 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Fügen Sie einen Tropfen der negativen Perlen (weiße Kappe) aus der Amin reaktive Perlen. Fügen Sie 0,2 ml Durchflusspuffer hinzu.</li>
		<li>Erstellen Sie die verbleibenden SCCs, indem Sie einen Tropfen positiver Färbeperlen (grüne Kappe) aus dem Anti-Ratten- und Antihamster-Ig-Kappa-Perlenset hinzufügen, gefolgt von der aufgeführten Antikörpermenge (Tabelle 3) in einem 1,2 ml Titerrohr. 15 min bei 4 °C inkubieren. Fügen Sie einen Tropfen der negativen Perlen (weiße Kappe) aus der Anti-Ratte und Anti-Hamster Ig kappa Perlen-Set. Fügen Sie 0,2 ml Durchflusspuffer hinzu.</li>
		<li>Wirbel alle Perlenmischungen vollständig. ScCs bei 4 °C für bis zu 3 Tage lagern. HINWEIS: Das SCC für fluoreszierende Reportermäuse sind ungefärbte Zellen.</li>
		<li>Legen Sie beim Ausführen von SCCs Spannungen so fest, dass die SCC-Probe einen Spitzenwert hat, der größer ist als jede Fluoreszenz für eine Zelle im selben Detektorkanal. Darüber hinaus sollten Spannungen so eingestellt werden, dass jeder SCC mindestens 0,5 Log-Differenz zwischen dem Histogramm-Peak im Kanal von Interesse im Vergleich zu jedem anderen Kanal hat (Abbildung 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie Beispiele auf "Niedrig" aus, in dem Ereignisse/Sekunden unter 4000 bleiben. Wenn die Durchflussmenge nicht entsprechend gesenkt werden kann, verdünnen Sie Proben mit zusätzlichem Kaltflusspuffer. Zeichnen Sie das hinzugefügte Volumen auf, da dies für die Zählberechnung erforderlich ist (siehe repräsentative Ergebnisse).</li>
	<li>Sammeln Sie mindestens 3 x 106 Ereignisse pro Stichprobe. Dies kann höher sein als die Zellzahl aufgrund von Pigmentgranulat und Schmutz, der als Ereignisse auf Ihrem Zytometer zählt.</li>
	<li>Zeichnen Sie eine Fluoreszenz Minus One (FMO) für jedes Fluorophor außer Live/Dead für eine korrekte Gating-Strategie in Abschnitt 6.4 auf. Ein FMO ist eine Probe, die mit allen Fluorophoren bis auf eine gefärbt wurde.</li>
	<li>Durchflusszytometer gemäß Hersteller- oder Anlagenanweisungen reinigen und herunterfahren.</li>
</ol>6. Anmerkung der Durchflusszytometriedaten
<ol><li>Öffnen Sie ein neues Arbeitsblatt mit Analysesoftware. Importieren Sie FCS-Dateien aus dem Zytometer für alle Proben und einfarbigen Steuerelemente.</li>
	<li>Verwenden Sie SCCs, um eine Kompensationsmatrix zu erstellen.</li>
	<li>Wenden Sie die Kompensationsmatrix auf Ihre gebeizten Proben und FMOs an.</li>
	<li>Verwenden Sie die FMOs, um positive Färbung zu bestimmen, um Tore zu ziehen.</li>
</ol>

<ol>
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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Eye+Enucleation+for+Remote+High-throughput+Phenotyping.">Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3814 (2011).</li><li>Makinde, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Microglia-Specific+Transcriptional+Signature+Correlates+with+Behavioral+Deficits+in+Neuropsychiatric+Lupus.">A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus.</a> Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).</li><li>Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+depletion+inhibits+experimental+choroidal+neovascularization.">Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).</li><li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization:+nomenclature+and+experimental+guidelines.">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li><li>Liyanage, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+inflammatory+and+resident+myeloid+populations+in+mouse+ocular+inflammatory+models.">Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models.</a> Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).</li><li>Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cell+Suspensions+Isolated+from+Solid+Tissues+by+Spectral+Flow+Cytometry.">Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Multiparameter-Durchflusszytometrie ermöglicht die quantitative Analyse mehrerer Zelltypen in einem komplexen Gewebe. In diesem Bericht beschreiben wir die zytometrische Durchflussdetektion mononuklearer Phagozytenpopulationen, einschließlich Monozyten, dendritischen Zellen und Makrophagen-Untergruppen, nach Laserverletzungen im Mausauge. Liyanage et al vor kurzem berichtet eine ähnliche Gating-Strategie, um Neutrophile zu erkennen, Eosinophile, Lymphozyten, DCs, Makrophagen, infiltrierende Makrophagen, und Monozy...

Das angeborene Immunsystem umfasst mehrere Zelltypen, die die Komplementaktivierung und Entzündung stimulieren. Angeborene Immunzellen umfassen natürliche Killerzellen (NK) Zellen, Mastzellen, Basophile, Eosinophile, Neutrophile, und mononukleäre Phagozyten. Mononukleare Phagozyten, die aus Monozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen bestehen, wurden in die Pathophysiologie mehrerer ophthalmologischer Erkrankungen wie Uveitis, diabetische Retinopathie und altersbedingte Makuladegeneration (AMD)1verwickelt. In diesem Protokoll werden wir uns auf die Identifizierung mononuklearer Phagozyten mittels multiparameterr Flusszytometrieanalyse in einem Mausmodell der neovaskulären AMD2konzentrieren. Dieses Protokoll ist anpassungsfähig für Mausmodelle der diabetischen Retinopathie und/oder Uveitis, aber eine umfassendere Augensektion wird aufgrund der systemischen Natur dieser Krankheiten empfohlen.
Mononukleare Phagozyten exprimiert überlappende Zelloberflächenmarker. Langlebige Gewebe-Resident-Makrophagen und Mikroglia stammen aus dem aus dem Dottersack abgeleiteten Erythromyeloid-Vorläufer3, während das Recycling von Makrophagen und dendritischen Zellen sich vom Knochenmark-abgeleiteten makrophagenen dendritischen Zellvorläufer4unterscheidet. Zu den Mauszelloberflächenmarkern, die Monozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen gemeinsam sind, gehören CD45, CD11b5, F4/806, Cx3cr17und der intrazelluläre Marker Iba18. Um diese Herausforderung zu meistern, definiert die transkriptomische Analyse von Makrophagen, Monozyten und dendritischen Zellen aus mehreren Geweben CD64 als makrophagenspezifischen Zelloberflächenmarker6. Makrophagen wurden in der Iris, Der Aderhaut, dem Ziliarkörper und dem Sehnerv in gesunden Augen beschrieben3. Alternativ ist die dendritische Zellidentifikation schwieriger; Die spezifischste Methode der dendritischen Zellidentifikation erfordert eine Schicksalskartierung mit der Zbtb46-GFP-Reportermaus9. Unabhängig von dieser Reporterzeile kann die Expression von CD11c und MHCII in Verbindung mit dem Fehlen von CD64 potenzielle dendritische Zellen6,10identifizieren. Dendritische Zellen wurden in Hornhaut, Bindehaut, Iris und Aderhaut in normalen Augen11identifiziert. Mikroglia sind spezialisierte Makrophagen in der Netzhaut, geschützt durch die Blut-Retina-Barriere, und abgeleitet von Dotter-Sac-Vorläuferzellen12. Dadurch kann die retinale Mikroglia von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen durch ihre düsteren Konzentrationen von CD45-Expression13 und hohen Konzentrationen von Tmem119 unterschieden werden, die als Durchflusszytometrie-Antikörper14erhältlich sind. Bei der Aktivierung von Mikroglia kann CD45 jedoch15 und Tmem119 herunterreguliert sein3, was die Komplexität der Mikrogliabiologie demonstriert, was die Komplexität der Mikrogliabiologie demonstriert, und dies ist wahrscheinlich sowohl für AMD als auch für sein Mausmodell relevant. Schließlich können Monozyten in mindestens zwei Subtypen unterteilt werden, darunter klassische und nicht-klassische. Klassische Monozyten zeigen CCR2+Ly6ChighCX3CR1Low Expression, und nicht-klassische Monozyten zeigen CCR2-Ly6ClowCX3CR1High Marker5.
Aufgrund der Notwendigkeit der quantitativen Analyse der Markerexpression, d.h. hoher im Vergleich zu niedrigen/niedrigen Konzentrationen, ist die Multiparameter-Flow-Zytometrie die ideale Methode zur Diskriminierung zwischen Monozyten, Makrophagen, Mikroglia und dendritischen Zellen im Auge und anderen Geweben. Weitere Vorteile sind die Identifizierung von Subpopulationen, die Möglichkeit, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) zur Sortierung von Zellpopulationen für transkriptomische oder proteomische Analysen zu verwenden, und Schicksalskartierung. Der Hauptnachteil der Multiparameter-Flow-Zytometrie ist der Mangel an Gewebearchitektur. Dies kann durch die ophthalmologische Dissektion in die verschiedenen okulären Subkompartimente überwunden werden: Hornhaut, Bindehaut, Iris, Linse, Netzhaut und Aderhautsklera-Komplex. Darüber hinaus kann eine bestätigende Immunfluoreszenz-Bildgebung durchgeführt werden, ist jedoch durch die Anzahl der Marker und den Mangel an robuster Quantifizierung begrenzt.
Genomweite Assoziationsstudien haben mehrere Komplementgene mit AMD16verknüpft. Die Komplementaktivierung führt zur Anaphylatoxinproduktion, Zur Rekrutierung von Leukozyten und zu einer daraus resultierenden Entzündung. Bei Komplementrezeptor-Mangelmäusen reduziert die Laserverletzung die mononukleäre Phagozytenrekrutierung und den laserinduzierten choroidalen Neovaskularisationsbereich (CNV)17. In ähnlicher Weise zeigt die C-C-Motiv-Chemokin-Rezeptor-2 (CCR2)-Knockout-Maus, die einen Mangel an Monozytenrekrutierung im Gewebe hat, sowohl eine verringerte mononukleäre Phagozytenrekrutierung als auch den laserinduzierten CNV-Bereich18. Diese Daten verbinden Komplement und mononukleäre Phagozyten mit experimenteller CNV und möglicherweise neovaskulärer AMD. Zur Unterstützung dieser Assoziation werden Komplementrezeptoren bei Patienten mit neovaskulärer AMD19,20. Diese Daten zeigen einen starken Zusammenhang zwischen AMD und mononukleären Phagozyten.
In diesem Manuskript verwenden wir das experimentelle laserinduzierte CNV-Modell, um die mononukleären Phagozytenpopulationen im Mausauge mittels Multiparameter-Flow-Zytometrie zu charakterisieren. Laserinduzierte CNV ist das Standard-Mausmodell der neovaskulären AMD, das die Wirksamkeit der aktuellen ersten linie neovaskulären AMD-Therapie21demonstrierte. Dieses Protokoll beschreibt die Enukleation von Mausaugen, die Augensektion, die Verdauung in eine Einzelzellsuspension, die Antikörperfärbung, die Bestimmung von Laserspannungen mit Einzelfarbsteuerungen und die Gating-Strategie mit Fluoreszenz minus eins (FMO) Kontrollen. Eine detaillierte Beschreibung des laserinduzierten CNV-Modells finden Sie in einer früheren Publikation22. Mit diesem Protokoll definieren wir Mikroglia, Monozyten, dendritische Zellen und Makrophagenpopulationen. Darüber hinaus werden wir MHCII und CD11c verwenden, um Makrophagen-Teilmengen innerhalb des laserinduzierten CNV-Modells weiter zu definieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.6 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>431031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conicals</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x HBSS, 500 ml</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 ml syringe</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>7886-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% paraformaldehyde solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>431032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needle</td>
			<td>Exel</td>
			<td>26437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3ml luer lock syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-732-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conicals</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well, U-bottom assay plate without lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine reactive beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td>v 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compensation beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>01-1111-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Count beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>01-1234-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion enzyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>National Optical and Scientific Instruments, Inc.</td>
			<td>DC3-420T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Diva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>17035X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamster anti-mouse CD11c BV421</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-210-123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing solution, 10x solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro titer tube and rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse CD64 PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>139304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipet tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P2404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 pipet tips</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22491806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10003M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipet tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet man</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB14955202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse B220 PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD19 PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD4 PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD45 FITC</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD8 PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ly6C</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ly6G PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>107622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Siglec F PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>311DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water, 500 ml</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A12873-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging bucket centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5910 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue, 0.4% solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digestion of whole mouse eyes for multi-parameter flow cytometric analysis of mononuclear phagocytes

Das angeborene Immunsystem spielt eine wichtige Rolle in der okulären Pathophysiologie, einschließlich Uveitis, diabetischer Retinopathie und altersbedingter Makuladegeneration. Angeborene Immunzellen, insbesondere mononukleäre Phagozyten, exprimieren überlappende Zelloberflächenmarker, was die Identifizierung dieser Populationen zu einer Herausforderung macht. Die Multiparameter-Durchflusszytometrie ermöglicht die gleichzeitige, quantitative Analyse mehrerer Zelloberflächenmarker, um Monozyten, Makrophagen, Mikroglia und dendritische Zellen in Mausaugen zu unterscheiden. Dieses Protokoll beschreibt die Enukleation ganzer Mausaugen, die Augensektion, die Verdauung in eine einzellige Suspension und die Färbung der einzelzelligen Suspension für myeloische Zellmarker. Darüber hinaus erklären wir die richtigen Methoden zur Bestimmung von Spannungen mit Einzelfarbsteuerungen und zur Abgrenzung positiver Tore mit Fluoreszenz minus 1 Steuerung. Die Hauptbeschränkung der Multiparameter-Flow-Zytometrie ist das Fehlen von Gewebearchitektur. Diese Einschränkung kann durch Multiparameter-Flow-Zytometrie einzelner Augenkompartimente oder kostenlose Immunfluoreszenzfärbung überwunden werden. Die Immunfluoreszenz wird jedoch durch den Mangel an quantitativer Analyse und die geringere Anzahl von Fluorophoren auf den meisten Mikroskopen begrenzt. Wir beschreiben den Einsatz multiparametrischer Durchflusszytometrie zur hochquantitativen Analyse mononuklearer Phagozyten in laserinduzierter choroidaler Neovaskularisation. Darüber hinaus kann die Multiparameter-Durchflusszytometrie zur Identifizierung von Makrophagen-Teilmengen, Schicksalskartierung und Zellsortierung für transkriptomische oder proteomische Studien verwendet werden.

Abbildung 1 zeigte unkompensierte Frequenzhistogramme für die SCCs und Zellen für den roten Laser: Alexa647, Alexa700 und APC-Cy7. In Abbildung 1Azeigte die Magentalinie den Peak des SCC für Alexa647, während die Cyanlinie den beabsichtigten Unterschied von 0,5 Log zeigte. Beachten Sie, dass der Gipfel in Alexa700 und APC-Cy7 links (weniger hell) der Cyan-Linie war. Beachten Sie auch, dass sich die Zellen alle links von der Magentalinie befanden. Zellen rech...

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Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

Verdauung von Ganzmausaugen für multiparameterflow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagozyten

Dieses Protokoll bietet eine Methode, um ganze Augen in eine einzelzellige Suspension zum Zweck der multiparametern Flow-Zytometrie-Analyse zu verdauen, um spezifische mononukleäre phagozytische Populationen zu identifizieren, einschließlich Monozyten, Mikroglia, Makrophagen und dendritischen Zellen.

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. ...

digestion-whole-mouse-eyes-for-multi-parameter-flow-cytometric

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

4.8K Aufrufe.  Northwestern University. Dieses Protokoll bietet eine Methode, um ganze Augen in eine einzelzellige Suspension zum Zweck der multiparametern Flow-Zytometrie-Analyse zu verdauen, um spezifische mononukleäre phagozytische Populationen zu identifizieren, einschließlich Monozyten, Mikroglia, Makrophagen und dendritischen Zellen.

Serie: Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Whole-Tier Imaging und Fließzytometrieverfahren zur Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten nach der Nanopartikel-Impfung

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolation und Analyse über Durchflusszytometrie von Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn der Maus

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 malignant gliomas soon after intracranial engraftment if the cancer cells are rendered deficient in their expression of the &#946;-galactoside-binding lectin galectin-1 (gal-1). More recent work now shows that a population of Gr-1+/CD11b+ myeloid cells is critical to this effect. To better understand the mechanisms by which NK and myeloid cells cooperate to confer gal-1-deficient tumor rejection we have developed a comprehensive protocol for the isolation and analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The method is demonstrated here by comparing PBMC infiltration into the tumor microenvironment of gal-1-expressing GL26 gliomas with those rendered gal-1-deficient via shRNA knockdown. The protocol begins with a description of&#160;how to culture and prepare GL26 cells for inoculation into the syngeneic C57BL/6J mouse brain. It then explains the steps involved in the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs from the early brain tumor microenvironment. The method is adaptable to a number of in vivo experimental designs in which temporal data on immune infiltration into the brain is required. The method is sensitive and highly reproducible, as glioma-infiltrating PBMCs can be isolated from intracranial tumors as soon as 24 hr post-tumor engraftment with similar cell counts observed from time point matched tumors throughout independent experiments. A single experimentalist can perform the method from brain harvesting to flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs in roughly 4-6 hr depending on the number of samples to be analyzed. Alternative glioma models and/or cell-specific detection antibodies may also be used at the experimentalists&#8217; discretion to assess the infiltration of several other immune cell types of interest without the need for alterations to the overall procedure.

Presented here is a straightforward method for the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells that yields time-dependent quantitative data on the number and activation status of immune cells entering the early brain tumor microenvironment.

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie von Gliom-Infiltration peripheren mononukleären Blutzellen

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Isolierung und Durchflusszytometrie Charakterisierung von murinen Dünndarms Lymphozyten

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of monocytes induces effector functions and a concomitant shift from oxidative to glycolytic metabolism that is accompanied by increased glucose transporter expression. This increased glycolytic metabolism is also observed for trained immunity of monocytes, a form of innate immunological memory. Although in vitro protocols examining glucose transporter expression and glucose uptake by monocytes have been described, none have been examined by multi-parametric flow cytometry in whole blood. We describe a multi-parametric flow cytometric protocol for the measurement of fluorescent glucose analog 2-NBDG uptake in whole blood by total monocytes and the classical (CD14++CD16-), intermediate (CD14++CD16+) and non-classical (CD14+CD16++) monocyte subpopulations. This method can be used to examine glucose transporter expression and glucose uptake for total monocytes and monocyte subpopulations during homeostasis and inflammatory disease, and can be easily modified to examine glucose uptake for other leukocytes and leukocyte subpopulations within blood.

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

Eine einfache Durchflusszytometrischer Methode Glukoseaufnahme und Glukosetransporter-Expression für Monozytensubpopulationen in Vollblut zu messen

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

Durchflusszytometrische Analyse von partikelgebundenen Bet v 1 Allergens in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Durchflusszytometrische Analyse von natürlichen Killerzellen lytische Aktivität in menschlichem Vollblut

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie der Menschen Endozervikale Gamma-Delta-T-Zellen

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

Charakterisierung der menschliche Monocyte Teilmengen von Vollblut Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

Verdauung der murinen Leber für eine durchflusszytometrischen Analyse der lymphatische Endothelial Zellen

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...