A JAL foi apoiada pela concessão do NIH K08EY030923; A CMC foi apoiada por uma bolsa K01 (5K01AR060169) do Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticos do NIH e uma Nova Bolsa de Pesquisa (637405) da Lupus Research Alliance.

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade northwestern. Os camundongos C57BL/6 foram alojados em uma instalação de barreira no Centro de Medicina Comparada da Universidade northwestern (Chicago, IL). Todos os animais foram alojados em ciclo claro/escuro de 12/12 h com livre acesso a alimentos e água.
1. Coleta de tecido ocular
<ol><li>Sacrificar ratos C57BL/6J de 10-12 semanas de idade de ambos os sexos usando administração regulamentada de dióxido de carbono até que o rato não responda e não inale mais. Realize deslocamento cervical ou outro método secundário aprovado para garantir a eutanásia. NOTA: A perfusão transcárvia pode ser realizada para remover leucócitos circulantes que não estão nos tecidos oculares. Neste experimento, a perfusão sistêmica não reduz o número de microglias, monócitos, macrófagos ou células dendríticas detectadas em olhos inteiros tratados sem tratamento ou laser. Portanto, a maioria desses tipos de células estão localizados nos tecidos oftálmicos e esta etapa é opcional.</li>
	<li>Para enuclear os olhos, empurre para baixo perto da órbita ocular enquanto coloca um par de fórceps curvados suavemente sob o olho enquanto ele se destaca fora da tomada. Pinças fechadas sob o olho sem apertar o olho real. Desalojar o olho da conjuntiva circundante (veja a publicação anterior)23.</li>
	<li>Puxe o olho lateralmente até que o nervo óptico seja a única conexão restante para desacopcular o olho. O nervo óptico muitas vezes rompe com a tensão, mas uma pequena tesoura às vezes é necessária para cortar o nervo óptico. Coloque o olho no frio 1x Hank's Buffered Saline Solution (HBSS) com cálcio e magnésio em tubo de microcentrifuge de 1,7 mL.</li>
</ol>2. Digestão do tecido ocular
<ol><li>Prepare o tampão de digestão contendo enzima de digestão de 0,1 mg/mL e 0,2 mg/mL DNase em HBSS frio. Reconstituir enzima de digestão de 5 mg em 2 mL de água estéril inicialmente. Prepare uma diluição inicial de 10 mg/mL DNase no HBSS. Para cada 10 mL do tampão de digestão (suficiente para 3 animais) misture 9,4 mL de HBSS frio com 0,4 mL de enzima de digestão reconstituída e 0,2 mL de DNase I diluída. NOTA: Essas concentrações foram empiricamente determinadas em vários experimentos para fornecer níveis ideais de coloração de anticorpos de células únicas, ao mesmo tempo em que reduziram a morte celular. A colagenase D foi testada como alternativa à enzima de digestão com viabilidade celular reduzida e diminuição das células CD45+ Consulte Discussão para obter mais detalhes sobre o processo iterativo para otimizar a digestão.</li>
	<li>Sob um microscópio dissecando a 10x de ampliação total, remova o nervo conjuntivo e óptico restante usando fórceps finos e tesouras de mola em HBSS frio.</li>
	<li>Mova os olhos limpos para um prato de dissecação seca ou pequeno barco de pesagem. Injete 0,15-0,20 mL/olho de tampão de digestão através de seringa equipada com agulha de 30 G na cavidade vítrea após duas feridas perfurantes serem feitas no olho através do eixo visual e 90° de distância desta primeira ferida para saída de tampão de digestão.</li>
	<li>Pique os olhos inteiros usando tesouras de mola e fórceps finos com todas as peças menores que 0,5 mm x 0,5 mm. Dissociar tecido de lente com interrupção mecânica contundente através de fórceps para evitar entupir pontas de pipeta nas etapas subsequentes. Para cada amostra, enxágue fórceps e tesouras cada uma com 0,75 mL de tampão de digestão em prato pequeno. Use um novo prato para cada amostra.</li>
	<li>Transfira o conteúdo do prato para um tubo de dissociação no gelo usando pipeta P1000 tomando cuidado para não perder nenhum material na transferência de pipeta. Enxágüe o prato com 1,5 mL adicional de tampão de digestão, elevando o volume total no tubo de dissociação para 3,25-3,50 mL.</li>
	<li>Coloque o tubo de dissociação invertido em dissociador eletrônico e execute o ciclo "m_brain_03_01", consistindo de rotação unidirecional de 1 min a 200 rpm à temperatura ambiente, que é um programa pré-carregado. Certifique-se de que todo o tecido está na parte inferior do tubo de dissociação em contato com o tampão de digestão e o rotor para este e todos os passos restantes.</li>
	<li>Coloque o tubo de dissociação na incubadora de agitação por 30 min a 200 rpm a 37 °C.</li>
	<li>Repita as etapas 2.6 e 2.7 uma vez adicional. Após a segunda incubação de 30 min realizar uma digestão mecânica final usando dissociador eletrônico como na etapa 2.6.</li>
	<li>Pare a reação adicionando 10 mL de tampão de fluxo frio e coloque tubos no gelo.</li>
</ol>3. Preparação da suspensão celular
<ol><li>Para criar suspensão unicelular, despeje a reação de digestão ocular parada através de um filtro de 40 μm colocado na parte superior de um tubo de centrífuga cônica de 50 mL. Usando o êmbolo de uma seringa de 2,5 mL, empurre todos os pedaços restantes de tecido ocular não digerido através do filtro.</li>
	<li>Lave o tubo de dissociação com 10 mL de tampão de fluxo e enxágue o filtro antes de usar o mesmo êmbolo para passar novamente pedaços de tecido ocular não digerido através do filtro.</li>
	<li>Repita o passo 3.2 usando 5 mL de buffer Flow.</li>
	<li>Lave o tubo de dissociação e o filtro com um tampão final de 10 mL de flow. NOTA: O volume total de digestão e tampão de fluxo é de cerca de 38-40 mL para cada amostra.</li>
	<li>Centrifugar o tubo cônico a 400 x g por 10 min a 4 °C. Decante o supernatante sem perturbar a pelota celular.</li>
	<li>Prepare a solução 1x lysing adicionando solução de 10x de lise à água estéril. Quebre a pelota movendo o tubo contra outro tubo. Para lise os glóbulos vermelhos, adicione 1 mL de solução de 1x lysing para 30 s com redemoinhos à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Pare a reação com 20 mL de buffer Flow.</li>
	<li>Centrifugar o tubo cônico a 400 x g por 10 min a 4 °C. Decante o supernatante sem perturbar a pelota celular.</li>
	<li>Dissociar a pelota movendo o tubo contra outro tubo. Adicione 5 mL de HBSS frio 1x por tubo.</li>
	<li>Tubos centrífugas a 400 x g por 10 min a 4 °C. Aspirante supernante.</li>
</ol>4. Coloração de suspensão celular para fagocitos mononucleares
<ol><li>Prepare 0,5 mL de mancha viva/morta por amostra diluindo o corante Live/Dead 1:5.000 em HBSS frio.</li>
	<li>Adicione a mancha Viva/Morta a cada amostra usando uma pipeta P1000 certificando-se de dissociar completamente a pelota. Transfira amostras para tubos micro titer de 1,2 mL.</li>
	<li>Tome uma pequena alíquota (10 μL) para contar células usando um hemócitometro ou contador automático de células (ver 4.4). Incubar amostras com mancha viva/morta por 15 minutos à temperatura ambiente no escuro.</li>
	<li>Conte células usando azul Trypan para determinar o número de células vivas por amostra. NOTA: Normalmente, 2 olhos de um mouse C57BL/6J de 10-12 semanas de idade contêm menos de 2 x 106 células vivas.</li>
	<li>Lave as amostras adicionando 400 μL de tampão de fluxo frio. Tubos centrífugas em um rack de tubo micro titer a 400 x g por 10 min a 4 °C. Aspire o supernante sem perturbar a pelota celular.</li>
	<li>Células resuspendas completamente em 500 μL de tampão de fluxo frio. Tubos centrífugas em um rack de tubo micro titer a 400 x g por 10 min a 4 °C. Aspire o supernante sem perturbar a pelota celular.</li>
	<li>Bloqueie até 5 x 106 células vivas em 50 μL de bloco Fc (diluição de 1:50 em tampão de fluxo frio do camundongo purificado CD16/CD32). Se mais de 5 x 106 células vivas, aumente os volumes adequadamente.</li>
	<li>Adicione o bloco Fc à pelota, certificando-se de dissociar completamente a amostra. Incubar por 20 min a 4 °C.</li>
	<li>Adicione 50 μL de solução de coloração de anticorpos (ver Tabela 1 para escolha e quantidade de cada anticorpo que está incluído na solução) por 5 x 10 6 células vivasdiretamente às células no bloco Fc e misture completamente. Incubar por 30 min a 4 °C. NOTA: As quantidades de anticorpos dependem da configuração do citómetro de fluxo e devem ser tituladas independentemente para cada laboratório e instrumento. Consulte a Tabela 2 para a configuração do instrumento de filtros e espelhos. Para titular anticorpos, comece com a recomendação do fabricante e calcule o índice de coloração. Realize um teste de diferentes concentrações de anticorpos (acima e abaixo da recomendação do fabricante) e escolha a menor concentração de anticorpos onde o índice de coloração é mantido. Além disso, certifique-se de que a coloração positiva seja menos brilhante do que o controle de cor única. Use células não manchadas para garantir que as células manchadas negativamente estejam em escala e tenham um pico inferior ou inferior a 1 x 102. Use uma fluorescência menos um controle para definir as células manchadas positivamente.</li>
	<li>Lave as amostras adicionando 700 μL de tampão de fluxo frio. Tubos centrífugas em um rack de tubo micro titer a 400 x g por 10 min a 4 °C. Aspire o supernante sem perturbar a pelota celular.</li>
	<li>Opcionalmente, após a coloração do anticorpo, as amostras podem ser fixadas com 500 μL de 2% de paraformaldeído no buffer Flow. Conserte amostras por 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, realize uma lavagem como descrito em 4.10. Armazene amostras fixas a 4 °C. As contas de contagem devem ser adicionadas no dia da coleta de dados de citometria de fluxo. As amostras fixas devem ser executadas no citômetro de fluxo em 1-2 dias. ATENÇÃO: O paraformaldeído é um risco corrosivo e para a saúde.</li>
	<li>Lave novamente as amostras usando 500 μL de tampão de fluxo frio. Tubos centrífugas em um rack de tubo micro titer a 400 x g por 10 min a 4 °C. Aspirar metade do supernante sem perturbar a pelota celular.</li>
	<li>Resuspend pelotas e transferir para um poço 96 bem, placa de ensaio u-bottom. Placa centrífuga a 400 x g por 5 min a 4 °C. Para decantar o supernasce, vire a placa e em um forte shake desaloja o líquido em uma bacia de pia, sem perturbar a pelota.</li>
	<li>Em um novo tubo de 1,2 mL micro titer, coloque 50 μL de contas de contagem bem vórtices.</li>
	<li>Resuspend pelotas em 96 placas de poço em 200 μL de tampão de fluxo frio. Adicione a mistura celular na parte superior das contas da etapa anterior. Execute no citómetro de fluxo em volume total de 250 μL / micro tubo de titulação.</li>
</ol>5. Coleta de dados de citometria de fluxo
<ol><li>Ligue e prepare o citômetro de fluxo. As instruções aqui listadas são para um cicímetro laser modificado(Tabela 2).</li>
	<li>Execute uma amostra de teste, que inclui uma pequena alíquota de cada amostra, para garantir que todas as células estejam em escala para cada detector. Ajuste as tensões para que todas as células estejam em escala.</li>
	<li>Execute controles de cor única (CCS) para cada fluoróforo usado no coquetel de coloração(Tabela 3). Coloque o tubo de micro titer em um tubo de poliestireno maior de 5 mL para colocação no estágio do citômetro de fluxo. NOTA: Fluoroforos radiculares como BV421 (Pacific Blue), FITC, PE, Alexa647 (APC) e Alexa700 não requerem o mesmo anticorpo que o coquetel (ou seja, CD19 PE para CD64 PE). No entanto, fluoroforos tandem como PE-CF594, PE-Cy7 ou APC-Cy7 requerem o mesmo anticorpo para CCS como coquetel devido à possível dissociação dos fluoroforos conjugados.<ol>
<li>Crie o CCS para BV421 adicionando 2 gotas de contas de compensação a um tubo de titer de 1,2 mL, juntamente com 1 μL de hamster anti-mouse CD11c BV421. As contas de compensação são usadas porque o CD11c BV421 é um subtipo de lambda IgG em vez de kappa, conforme descrito em 5.3.3. Incubar por 15 minutos a 4 °C. Adicione 0,2 mL de tampão de fluxo.</li>
		<li>Crie o SCC para o corante Live/Dead adicionando uma gota de contas de coloração positiva (tampa verde) das contas reativas de amina, seguida por 1 μL de corante Vivo/Morto. Incubar por 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. Adicione uma gota das contas negativas (tampa branca) das contas reativas de amina. Adicione 0,2 mL de tampão de fluxo.</li>
		<li>Crie os CCs restantes adicionando uma gota de contas de coloração positiva (tampa verde) do conjunto de contas anti-rato e anti-hamster Ig kappa, seguido pela quantidade de anticorpos listada(Tabela 3) em um tubo de titer de 1,2 mL. Incubar por 15 min a 4 °C. Adicione uma gota das contas negativas (tampa branca) do conjunto de contas anti-rato e anti-hamster Ig kappa. Adicione 0,2 mL de tampão de fluxo.</li>
		<li>Vórtice todas as misturas de contas completamente. Armazenar SCCs a 4 °C por até 3 dias. NOTA: O CCS para ratos repórteres fluorescentes são células não manchadas.</li>
		<li>Ao executar SCCs, defina tensões de tal forma que a amostra de CCS tenha um pico maior do que qualquer fluorescência para uma amostra de células no mesmo canal do detector. Além disso, as tensões devem ser definidas para que qualquer CCS tenha pelo menos uma diferença de log de 0,5 entre o pico do histograma no canal de interesse versus qualquer outro canal(Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute amostras em eventos de manutenção "Baixa"/segundo abaixo de 4000. Se a taxa de fluxo não puder ser reduzida adequadamente, diluir amostras com buffer de fluxo frio adicional. Registo o volume adicionado, pois isso será necessário para o cálculo da contagem (veja os resultados representativos).</li>
	<li>Coletar pelo menos 3 x 106 eventos por amostra. Isso pode ser maior do que o número de células devido a grânulos de pigmento e detritos contando como eventos em seu cítmetro.</li>
	<li>Registo uma Fluorescência Menos Um (FMO) para cada fluoróforo que não seja Live/Dead para a estratégia adequada de gating na seção 6.4. Um FMO é uma amostra que foi manchada com todos os fluoroforos, exceto um.</li>
	<li>Limpe e desligue o citômetro de fluxo de acordo com as instruções do fabricante ou da instalação.</li>
</ol>6. Anotação dos dados de citometria de fluxo
<ol><li>Abra uma nova planilha usando software de análise. Importar arquivos FCS de citômetro para todas as amostras e controles de cor única.</li>
	<li>Use SCCs para criar uma matriz de compensação.</li>
	<li>Aplique a matriz de compensação às suas amostras manchadas e FMOs.</li>
	<li>Use as FMOs para determinar a coloração positiva para desenhar portões.</li>
</ol>

<ol>
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K., van Rooijen, N., Ambati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+depletion+inhibits+experimental+choroidal+neovascularization.">Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).</li><li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization:+nomenclature+and+experimental+guidelines.">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li><li>Liyanage, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+inflammatory+and+resident+myeloid+populations+in+mouse+ocular+inflammatory+models.">Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models.</a> Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).</li><li>Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cell+Suspensions+Isolated+from+Solid+Tissues+by+Spectral+Flow+Cytometry.">Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A citometria de fluxo de vários parâmetros permite a análise quantitativa de múltiplos tipos de células em um tecido complexo. Neste relatório, descrevemos a detecção citométrica de fluxo de populações de fagocitos mononucleares, incluindo monócitos, células dendríticas e subconjuntos de macrófagos, após lesão a laser no olho do rato. Liyanage et al relataram recentemente uma estratégia semelhante de gating para detectar neutrófilos, eosinófilos, linfócitos, DCs, macrófagos, macrófagos infiltrados ...

O sistema imunológico inato inclui múltiplos tipos de células que estimulam a ativação e inflamação complementares. As células imunes inatas incluem células assassinas naturais (NK), células de mastro, basófilos, eosinófilos, neutrófilos e fagocitos mononucleares. Os fagocitos mononucleares, compostos por monócitos, macrófagos e células dendríticas, foram implicados na fisiopatologia de múltiplas condições oftálmicas, incluindo uveíte, retinopatia diabética e degeneração macular relacionada à idade (AMD)1. Neste protocolo, focaremos na identificação de faócitos mononucleares utilizando análises citométricas de fluxo de vários parâmetros em um modelo de mouse de AMD neovascular2. Este protocolo é adaptável para modelos de camundongos de retinopatia diabética e/ou uveíte, mas a dissecção ocular mais extensa é recomendada devido à natureza sistêmica dessas doenças.
Os fagocitos mononucleares expressam marcadores de superfície de células sobrepostos. Os macrófagos residentes de tecido de longa duração e a microglia são originários do progenitor de células eritrolóides derivados da gema3,enquanto a reciclagem de macrófagos e células dendríticas se diferenciam do progenitor de células dendríticas derivados da medula óssea4. Os marcadores de superfície de células do rato comuns a monócitos, macrófagos e células dendríticas incluem CD45, CD11b5, F4/806,Cx3cr17e o marcador intracelular Iba18. Para superar esse desafio, a análise transcriômica de macrófagos, monócitos e células dendríticas de múltiplos tecidos define CD64 como um marcador de superfície celular específico para macrófago6. Macrófagos foram descritos na íris, corpo ciliar, ciliar e nervo óptico em olhos saudáveis3. Alternativamente, a identificação de células dendríticas é mais difícil; o método mais específico de identificação celular dendrítica requer mapeamento do destino usando o mouse repórter Zbtb46-GFP9. Independente desta linha de repórteres, a expressão de CD11c e MHCII em conjunto com a ausência de CD64 pode identificar potenciais células dendríticas6,10. Células dendríticas foram identificadas em córnea, conjuntiva, íris e coroide em olhos normais11. Microglia são macrófagos especializados localizados na retina, protegidos pela barreira hemrateira-retina, e derivados de células progenitoras do sac gema12. Como resultado, a microglia da retina pode ser diferenciada dos macrófagos derivados de monócitos por seus níveis fracos de expressão CD4513 e altos níveis de Tmem119, que está disponível como anticorpo citometria de fluxo14. Após a ativação da microglia, no entanto, o CD45 pode ser regulado15 e O Tmem119 pode ser regulado3, demonstrando a complexidade da biologia da microglia e isso é provavelmente relevante tanto na AMD quanto em seu modelo de mouse. Finalmente, os monócitos podem ser divididos em pelo menos dois subtipos, incluindo clássico e não clássico. Monócitos clássicos exibem ccr2+Ly6Caltabaixa expressão CX3CR1, e monócitos não clássicos demonstram CCR2-Ly6CbaixoCX3CR1marcadores altos 5.
Devido à necessidade da análise quantitativa da expressão marcadora, ou seja, níveis altos versus baixos/fracos, a citometria de fluxo de vários parâmetros é o método ideal para a discriminação entre monócitos, macrófagos, microglia e células dendríticas no olho e outros tecidos. Outras vantagens incluem a identificação de sub populações, a capacidade de usar a triagem celular ativada por fluorescência (FACS) para classificar populações celulares para análise transcriômica ou proteômica e mapeamento do destino. A maior desvantagem da citometria de fluxo de vários parâmetros é a falta de arquitetura tecidual. Isso pode ser superado pela dissecção oftálmica nos diversos subcoentamentos oculares: córnea, conjuntiva, íris, lente, retina e complexo coroide-esclera. Além disso, a imagem confirmatória de imunofluorescência pode ser realizada, mas é limitada pelo número de marcadores e falta de quantitação robusta.
Estudos de associação de genomas associaram múltiplos genes complementares com a AMD16. A ativação complementar leva à produção de anafilatoxinas, recrutamento de leucócitos e inflamação resultante. Em camundongos deficientes receptores complementares, a lesão a laser reduz o recrutamento de fagocitos mononucleares e a área de neovascularização choroidal induzida por laser (CNV)17. Da mesma forma, o camundongo c-c 2 (CCR2), que é deficiente no recrutamento de monócitos para o tecido, demonstra tanto a diminuição do recrutamento de faócitos mononucleares quanto a área cnv induzida por laser18. Esses dados ligam complementos e fagocitos mononucleares com CNV experimental e possivelmente AMD neovascular. Em apoio a esta associação, os receptores complementares são desregulados em monócitos sanguíneos periféricos em pacientes com AMD neovascular19,20. Esses dados demonstram forte associação entre os faócitos AMD e mononucleares.
Neste manuscrito, usaremos o modelo experimental de CNV induzido a laser para caracterizar as populações de fagocites mononucleares no olho do rato usando citometria de fluxo de vários parâmetros. CnV induzida a laser é o modelo padrão do mouse da AMD neovascular, que demonstrou a eficácia da terapia de AMD neovascular de primeira linha atual21. Este protocolo descreverá a enucleação dos olhos do rato, dissecção ocular, digestão em uma única suspensão celular, coloração de anticorpos, determinação de tensões a laser usando controles de cor única e estratégia de gating usando controles de fluorescência menos um (FMO). Para obter uma descrição detalhada do modelo CNV induzido por laser, consulte uma publicação anterior22. Usando este protocolo, definiremos microglias, monócitos, células dendríticas e populações de macrófagos. Além disso, usaremos MHCII e CD11c para definir ainda mais subconjuntos de macrófago dentro do modelo CNV induzido a laser.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.6 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>431031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conicals</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x HBSS, 500 ml</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 ml syringe</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>7886-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% paraformaldehyde solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>431032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needle</td>
			<td>Exel</td>
			<td>26437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3ml luer lock syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-732-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conicals</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well, U-bottom assay plate without lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine reactive beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td>v 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compensation beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>01-1111-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Count beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>01-1234-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion enzyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>National Optical and Scientific Instruments, Inc.</td>
			<td>DC3-420T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Diva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>17035X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamster anti-mouse CD11c BV421</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-210-123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing solution, 10x solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro titer tube and rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse CD64 PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>139304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipet tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P2404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 pipet tips</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22491806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10003M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipet tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet man</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB14955202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse B220 PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD19 PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD4 PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD45 FITC</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD8 PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ly6C</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ly6G PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>107622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Siglec F PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>311DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water, 500 ml</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A12873-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging bucket centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5910 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue, 0.4% solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digestion of whole mouse eyes for multi-parameter flow cytometric analysis of mononuclear phagocytes

O sistema imunológico inato desempenha papéis importantes na fisiopatologia ocular, incluindo uveíte, retinopatia diabética e degeneração macular relacionada à idade. As células imunes inatas, especificamente os faócitos mononucleares, expressam marcadores de superfície celular sobrepostos, o que torna a identificação dessas populações um desafio. A citometria de fluxo de vários parâmetros permite a análise quantitativa simultânea de marcadores de superfície de múltiplas células, a fim de diferenciar monócitos, macrófagos, microglia e células dendríticas nos olhos do rato. Este protocolo descreve a enucleação de olhos inteiros do rato, dissecção ocular, digestão em uma única suspensão celular e coloração da suspensão de célula única para marcadores de células mielóides. Além disso, explicamos os métodos adequados para determinar tensões usando controles de cor única e para delinear portões positivos usando fluorescência menos um controles. A maior limitação da citometria de fluxo de vários parâmetros é a ausência de arquitetura tecidual. Essa limitação pode ser superada pela citometria de fluxo de vários parâmetros de compartimentos oculares individuais ou coloração de imunofluorescência complementar. No entanto, a imunofluorescência é limitada pela sua falta de análise quantitativa e pelo número reduzido de fluoroforos na maioria dos microscópios. Descrevemos o uso de citometria de fluxo multiparamétrico para fornecer análises altamente quantitativas de fagocitos mononucleares na neovascularização choroidal induzida por laser. Além disso, a citometria de fluxo de vários parâmetros pode ser usada para a identificação de subconjuntos de macrófagos, mapeamento de destinos e classificação celular para estudos transcriômicos ou proteômicos.

A Figura 1 mostrou histogramas de frequência não compensados para os SCCs e células para o laser vermelho: Alexa647, Alexa700 e APC-Cy7. Na Figura 1A,a linha magenta retratou o pico do CCS para Alexa647, enquanto a linha ciano mostrou a diferença de log pretendida de 0,5. Observe que o pico em Alexa700 e APC-Cy7 foi à esquerda (menos brilhante) da linha ciano. Note também que as células estavam todas à esquerda da linha magenta. As células à direita do...

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Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

Digestão de olhos inteiros de rato para análise citométrica de fluxo multi-parameter de fagocitos mononucleares

Este protocolo fornece um método para digerir olhos inteiros em uma única suspensão celular com o propósito de análise citométrica de fluxo de vários parâmetros, a fim de identificar populações fagocíticas mononucleares específicas, incluindo monócitos, microglia, macrófagos e células dendríticas.

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. ...

digestion-whole-mouse-eyes-for-multi-parameter-flow-cytometric

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

4.8K visualizações.  Northwestern University. Este protocolo fornece um método para digerir olhos inteiros em uma única suspensão celular com o propósito de análise citométrica de fluxo de vários parâmetros, a fim de identificar populações fagocíticas mononucleares específicas, incluindo monócitos, microglia, macrófagos e células dendríticas.

Vídeo: Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Imaginologia todo animal e técnicas de citometria de fluxo para CD8 + respostas de células T Análise do antigénio específico da Nanoparticle após vacinação

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Imunologia e Infecção

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 malignant gliomas soon after intracranial engraftment if the cancer cells are rendered deficient in their expression of the &#946;-galactoside-binding lectin galectin-1 (gal-1). More recent work now shows that a population of Gr-1+/CD11b+ myeloid cells is critical to this effect. To better understand the mechanisms by which NK and myeloid cells cooperate to confer gal-1-deficient tumor rejection we have developed a comprehensive protocol for the isolation and analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The method is demonstrated here by comparing PBMC infiltration into the tumor microenvironment of gal-1-expressing GL26 gliomas with those rendered gal-1-deficient via shRNA knockdown. The protocol begins with a description of&#160;how to culture and prepare GL26 cells for inoculation into the syngeneic C57BL/6J mouse brain. It then explains the steps involved in the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs from the early brain tumor microenvironment. The method is adaptable to a number of in vivo experimental designs in which temporal data on immune infiltration into the brain is required. The method is sensitive and highly reproducible, as glioma-infiltrating PBMCs can be isolated from intracranial tumors as soon as 24 hr post-tumor engraftment with similar cell counts observed from time point matched tumors throughout independent experiments. A single experimentalist can perform the method from brain harvesting to flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs in roughly 4-6 hr depending on the number of samples to be analyzed. Alternative glioma models and/or cell-specific detection antibodies may also be used at the experimentalists&#8217; discretion to assess the infiltration of several other immune cell types of interest without the need for alterations to the overall procedure.

Presented here is a straightforward method for the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells that yields time-dependent quantitative data on the number and activation status of immune cells entering the early brain tumor microenvironment.

Isolamento e Análise de Citometria de Fluxo infiltrantes Glioma Células Mononucleares do Sangue Periférico

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Isolamento e Caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino Intestino Delgado

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of monocytes induces effector functions and a concomitant shift from oxidative to glycolytic metabolism that is accompanied by increased glucose transporter expression. This increased glycolytic metabolism is also observed for trained immunity of monocytes, a form of innate immunological memory. Although in vitro protocols examining glucose transporter expression and glucose uptake by monocytes have been described, none have been examined by multi-parametric flow cytometry in whole blood. We describe a multi-parametric flow cytometric protocol for the measurement of fluorescent glucose analog 2-NBDG uptake in whole blood by total monocytes and the classical (CD14++CD16-), intermediate (CD14++CD16+) and non-classical (CD14+CD16++) monocyte subpopulations. This method can be used to examine glucose transporter expression and glucose uptake for total monocytes and monocyte subpopulations during homeostasis and inflammatory disease, and can be easily modified to examine glucose uptake for other leukocytes and leukocyte subpopulations within blood.

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

A Fluxo Simples Citometria método para medir glicose Captação e expressão de transportadores de glicose para monócitos subpopulações em sangue total

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

Citometria de fluxo de partículas ligadas aos Bet v 1 alérgeno no PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Citometria de fluxo e assassinas naturais celular Lytic Actividade em sangue total humano

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

Isolamento e Citometria de Fluxo Analysis of Human Endocervical Gama Cells Delta T

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

Caracterização de subconjuntos de monócitos humanos por sangue total Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

Digestão do fígado murino para um fluxo Cytometric análise de células endoteliais linfáticas

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...