A JAL foi apoiada pela concessão do NIH K08EY030923; A CMC foi apoiada por uma bolsa K01 (5K01AR060169) do Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticos do NIH e uma Nova Bolsa de Pesquisa (637405) da Lupus Research Alliance.

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade northwestern. Os camundongos C57BL/6 foram alojados em uma instalação de barreira no Centro de Medicina Comparada da Universidade northwestern (Chicago, IL). Todos os animais foram alojados em ciclo claro/escuro de 12/12 h com livre acesso a alimentos e água.
1. Coleta de tecido ocular
<ol><li>Sacrificar ratos C57BL/6J de 10-12 semanas de idade de ambos os sexos usando administração regulamentada de dióxido de carbono até que o rato não responda e não inale mais. Realize deslocamento cervical ou outro método secundário aprovado para garantir a eutanásia. NOTA: A perfusão transcárvia pode ser realizada para remover leucócitos circulantes que não estão nos tecidos oculares. Neste experimento, a perfusão sistêmica não reduz o número de microglias, monócitos, macrófagos ou células dendríticas detectadas em olhos inteiros tratados sem tratamento ou laser. Portanto, a maioria desses tipos de células estão localizados nos tecidos oftálmicos e esta etapa é opcional.</li>
	<li>Para enuclear os olhos, empurre para baixo perto da órbita ocular enquanto coloca um par de fórceps curvados suavemente sob o olho enquanto ele se destaca fora da tomada. Pinças fechadas sob o olho sem apertar o olho real. Desalojar o olho da conjuntiva circundante (veja a publicação anterior)23.</li>
	<li>Puxe o olho lateralmente até que o nervo óptico seja a única conexão restante para desacopcular o olho. O nervo óptico muitas vezes rompe com a tensão, mas uma pequena tesoura às vezes é necessária para cortar o nervo óptico. Coloque o olho no frio 1x Hank's Buffered Saline Solution (HBSS) com cálcio e magnésio em tubo de microcentrifuge de 1,7 mL.</li>
</ol>2. Digestão do tecido ocular
<ol><li>Prepare o tampão de digestão contendo enzima de digestão de 0,1 mg/mL e 0,2 mg/mL DNase em HBSS frio. Reconstituir enzima de digestão de 5 mg em 2 mL de água estéril inicialmente. Prepare uma diluição inicial de 10 mg/mL DNase no HBSS. Para cada 10 mL do tampão de digestão (suficiente para 3 animais) misture 9,4 mL de HBSS frio com 0,4 mL de enzima de digestão reconstituída e 0,2 mL de DNase I diluída. NOTA: Essas concentrações foram empiricamente determinadas em vários experimentos para fornecer níveis ideais de coloração de anticorpos de células únicas, ao mesmo tempo em que reduziram a morte celular. A colagenase D foi testada como alternativa à enzima de digestão com viabilidade celular reduzida e diminuição das células CD45+ Consulte Discussão para obter mais detalhes sobre o processo iterativo para otimizar a digestão.</li>
	<li>Sob um microscópio dissecando a 10x de ampliação total, remova o nervo conjuntivo e óptico restante usando fórceps finos e tesouras de mola em HBSS frio.</li>
	<li>Mova os olhos limpos para um prato de dissecação seca ou pequeno barco de pesagem. Injete 0,15-0,20 mL/olho de tampão de digestão através de seringa equipada com agulha de 30 G na cavidade vítrea após duas feridas perfurantes serem feitas no olho através do eixo visual e 90° de distância desta primeira ferida para saída de tampão de digestão.</li>
	<li>Pique os olhos inteiros usando tesouras de mola e fórceps finos com todas as peças menores que 0,5 mm x 0,5 mm. Dissociar tecido de lente com interrupção mecânica contundente através de fórceps para evitar entupir pontas de pipeta nas etapas subsequentes. Para cada amostra, enxágue fórceps e tesouras cada uma com 0,75 mL de tampão de digestão em prato pequeno. Use um novo prato para cada amostra.</li>
	<li>Transfira o conteúdo do prato para um tubo de dissociação no gelo usando pipeta P1000 tomando cuidado para não perder nenhum material na transferência de pipeta. Enxágüe o prato com 1,5 mL adicional de tampão de digestão, elevando o volume total no tubo de dissociação para 3,25-3,50 mL.</li>
	<li>Coloque o tubo de dissociação invertido em dissociador eletrônico e execute o ciclo "m_brain_03_01", consistindo de rotação unidirecional de 1 min a 200 rpm à temperatura ambiente, que é um programa pré-carregado. Certifique-se de que todo o tecido está na parte inferior do tubo de dissociação em contato com o tampão de digestão e o rotor para este e todos os passos restantes.</li>
	<li>Coloque o tubo de dissociação na incubadora de agitação por 30 min a 200 rpm a 37 °C.</li>
	<li>Repita as etapas 2.6 e 2.7 uma vez adicional. Após a segunda incubação de 30 min realizar uma digestão mecânica final usando dissociador eletrônico como na etapa 2.6.</li>
	<li>Pare a reação adicionando 10 mL de tampão de fluxo frio e coloque tubos no gelo.</li>
</ol>3. Preparação da suspensão celular
<ol><li>Para criar suspensão unicelular, despeje a reação de digestão ocular parada através de um filtro de 40 μm colocado na parte superior de um tubo de centrífuga cônica de 50 mL. Usando o êmbolo de uma seringa de 2,5 mL, empurre todos os pedaços restantes de tecido ocular não digerido através do filtro.</li>
	<li>Lave o tubo de dissociação com 10 mL de tampão de fluxo e enxágue o filtro antes de usar o mesmo êmbolo para passar novamente pedaços de tecido ocular não digerido através do filtro.</li>
	<li>Repita o passo 3.2 usando 5 mL de buffer Flow.</li>
	<li>Lave o tubo de dissociação e o filtro com um tampão final de 10 mL de flow. NOTA: O volume total de digestão e tampão de fluxo é de cerca de 38-40 mL para cada amostra.</li>
	<li>Centrifugar o tubo cônico a 400 x g por 10 min a 4 °C. Decante o supernatante sem perturbar a pelota celular.</li>
	<li>Prepare a solução 1x lysing adicionando solução de 10x de lise à água estéril. Quebre a pelota movendo o tubo contra outro tubo. Para lise os glóbulos vermelhos, adicione 1 mL de solução de 1x lysing para 30 s com redemoinhos à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Pare a reação com 20 mL de buffer Flow.</li>
	<li>Centrifugar o tubo cônico a 400 x g por 10 min a 4 °C. Decante o supernatante sem perturbar a pelota celular.</li>
	<li>Dissociar a pelota movendo o tubo contra outro tubo. Adicione 5 mL de HBSS frio 1x por tubo.</li>
	<li>Tubos centrífugas a 400 x g por 10 min a 4 °C. Aspirante supernante.</li>
</ol>4. Coloração de suspensão celular para fagocitos mononucleares
<ol><li>Prepare 0,5 mL de mancha viva/morta por amostra diluindo o corante Live/Dead 1:5.000 em HBSS frio.</li>
	<li>Adicione a mancha Viva/Morta a cada amostra usando uma pipeta P1000 certificando-se de dissociar completamente a pelota. Transfira amostras para tubos micro titer de 1,2 mL.</li>
	<li>Tome uma pequena alíquota (10 μL) para contar células usando um hemócitometro ou contador automático de células (ver 4.4). Incubar amostras com mancha viva/morta por 15 minutos à temperatura ambiente no escuro.</li>
	<li>Conte células usando azul Trypan para determinar o número de células vivas por amostra. NOTA: Normalmente, 2 olhos de um mouse C57BL/6J de 10-12 semanas de idade contêm menos de 2 x 106 células vivas.</li>
	<li>Lave as amostras adicionando 400 μL de tampão de fluxo frio. Tubos centrífugas em um rack de tubo micro titer a 400 x g por 10 min a 4 °C. Aspire o supernante sem perturbar a pelota celular.</li>
	<li>Células resuspendas completamente em 500 μL de tampão de fluxo frio. Tubos centrífugas em um rack de tubo micro titer a 400 x g por 10 min a 4 °C. Aspire o supernante sem perturbar a pelota celular.</li>
	<li>Bloqueie até 5 x 106 células vivas em 50 μL de bloco Fc (diluição de 1:50 em tampão de fluxo frio do camundongo purificado CD16/CD32). Se mais de 5 x 106 células vivas, aumente os volumes adequadamente.</li>
	<li>Adicione o bloco Fc à pelota, certificando-se de dissociar completamente a amostra. Incubar por 20 min a 4 °C.</li>
	<li>Adicione 50 μL de solução de coloração de anticorpos (ver Tabela 1 para escolha e quantidade de cada anticorpo que está incluído na solução) por 5 x 10 6 células vivasdiretamente às células no bloco Fc e misture completamente. Incubar por 30 min a 4 °C. NOTA: As quantidades de anticorpos dependem da configuração do citómetro de fluxo e devem ser tituladas independentemente para cada laboratório e instrumento. Consulte a Tabela 2 para a configuração do instrumento de filtros e espelhos. Para titular anticorpos, comece com a recomendação do fabricante e calcule o índice de coloração. Realize um teste de diferentes concentrações de anticorpos (acima e abaixo da recomendação do fabricante) e escolha a menor concentração de anticorpos onde o índice de coloração é mantido. Além disso, certifique-se de que a coloração positiva seja menos brilhante do que o controle de cor única. Use células não manchadas para garantir que as células manchadas negativamente estejam em escala e tenham um pico inferior ou inferior a 1 x 102. Use uma fluorescência menos um controle para definir as células manchadas positivamente.</li>
	<li>Lave as amostras adicionando 700 μL de tampão de fluxo frio. Tubos centrífugas em um rack de tubo micro titer a 400 x g por 10 min a 4 °C. Aspire o supernante sem perturbar a pelota celular.</li>
	<li>Opcionalmente, após a coloração do anticorpo, as amostras podem ser fixadas com 500 μL de 2% de paraformaldeído no buffer Flow. Conserte amostras por 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, realize uma lavagem como descrito em 4.10. Armazene amostras fixas a 4 °C. As contas de contagem devem ser adicionadas no dia da coleta de dados de citometria de fluxo. As amostras fixas devem ser executadas no citômetro de fluxo em 1-2 dias. ATENÇÃO: O paraformaldeído é um risco corrosivo e para a saúde.</li>
	<li>Lave novamente as amostras usando 500 μL de tampão de fluxo frio. Tubos centrífugas em um rack de tubo micro titer a 400 x g por 10 min a 4 °C. Aspirar metade do supernante sem perturbar a pelota celular.</li>
	<li>Resuspend pelotas e transferir para um poço 96 bem, placa de ensaio u-bottom. Placa centrífuga a 400 x g por 5 min a 4 °C. Para decantar o supernasce, vire a placa e em um forte shake desaloja o líquido em uma bacia de pia, sem perturbar a pelota.</li>
	<li>Em um novo tubo de 1,2 mL micro titer, coloque 50 μL de contas de contagem bem vórtices.</li>
	<li>Resuspend pelotas em 96 placas de poço em 200 μL de tampão de fluxo frio. Adicione a mistura celular na parte superior das contas da etapa anterior. Execute no citómetro de fluxo em volume total de 250 μL / micro tubo de titulação.</li>
</ol>5. Coleta de dados de citometria de fluxo
<ol><li>Ligue e prepare o citômetro de fluxo. As instruções aqui listadas são para um cicímetro laser modificado(Tabela 2).</li>
	<li>Execute uma amostra de teste, que inclui uma pequena alíquota de cada amostra, para garantir que todas as células estejam em escala para cada detector. Ajuste as tensões para que todas as células estejam em escala.</li>
	<li>Execute controles de cor única (CCS) para cada fluoróforo usado no coquetel de coloração(Tabela 3). Coloque o tubo de micro titer em um tubo de poliestireno maior de 5 mL para colocação no estágio do citômetro de fluxo. NOTA: Fluoroforos radiculares como BV421 (Pacific Blue), FITC, PE, Alexa647 (APC) e Alexa700 não requerem o mesmo anticorpo que o coquetel (ou seja, CD19 PE para CD64 PE). No entanto, fluoroforos tandem como PE-CF594, PE-Cy7 ou APC-Cy7 requerem o mesmo anticorpo para CCS como coquetel devido à possível dissociação dos fluoroforos conjugados.<ol>
<li>Crie o CCS para BV421 adicionando 2 gotas de contas de compensação a um tubo de titer de 1,2 mL, juntamente com 1 μL de hamster anti-mouse CD11c BV421. As contas de compensação são usadas porque o CD11c BV421 é um subtipo de lambda IgG em vez de kappa, conforme descrito em 5.3.3. Incubar por 15 minutos a 4 °C. Adicione 0,2 mL de tampão de fluxo.</li>
		<li>Crie o SCC para o corante Live/Dead adicionando uma gota de contas de coloração positiva (tampa verde) das contas reativas de amina, seguida por 1 μL de corante Vivo/Morto. Incubar por 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. Adicione uma gota das contas negativas (tampa branca) das contas reativas de amina. Adicione 0,2 mL de tampão de fluxo.</li>
		<li>Crie os CCs restantes adicionando uma gota de contas de coloração positiva (tampa verde) do conjunto de contas anti-rato e anti-hamster Ig kappa, seguido pela quantidade de anticorpos listada(Tabela 3) em um tubo de titer de 1,2 mL. Incubar por 15 min a 4 °C. Adicione uma gota das contas negativas (tampa branca) do conjunto de contas anti-rato e anti-hamster Ig kappa. Adicione 0,2 mL de tampão de fluxo.</li>
		<li>Vórtice todas as misturas de contas completamente. Armazenar SCCs a 4 °C por até 3 dias. NOTA: O CCS para ratos repórteres fluorescentes são células não manchadas.</li>
		<li>Ao executar SCCs, defina tensões de tal forma que a amostra de CCS tenha um pico maior do que qualquer fluorescência para uma amostra de células no mesmo canal do detector. Além disso, as tensões devem ser definidas para que qualquer CCS tenha pelo menos uma diferença de log de 0,5 entre o pico do histograma no canal de interesse versus qualquer outro canal(Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute amostras em eventos de manutenção "Baixa"/segundo abaixo de 4000. Se a taxa de fluxo não puder ser reduzida adequadamente, diluir amostras com buffer de fluxo frio adicional. Registo o volume adicionado, pois isso será necessário para o cálculo da contagem (veja os resultados representativos).</li>
	<li>Coletar pelo menos 3 x 106 eventos por amostra. Isso pode ser maior do que o número de células devido a grânulos de pigmento e detritos contando como eventos em seu cítmetro.</li>
	<li>Registo uma Fluorescência Menos Um (FMO) para cada fluoróforo que não seja Live/Dead para a estratégia adequada de gating na seção 6.4. Um FMO é uma amostra que foi manchada com todos os fluoroforos, exceto um.</li>
	<li>Limpe e desligue o citômetro de fluxo de acordo com as instruções do fabricante ou da instalação.</li>
</ol>6. Anotação dos dados de citometria de fluxo
<ol><li>Abra uma nova planilha usando software de análise. Importar arquivos FCS de citômetro para todas as amostras e controles de cor única.</li>
	<li>Use SCCs para criar uma matriz de compensação.</li>
	<li>Aplique a matriz de compensação às suas amostras manchadas e FMOs.</li>
	<li>Use as FMOs para determinar a coloração positiva para desenhar portões.</li>
</ol>

<ol>
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K., van Rooijen, N., Ambati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+depletion+inhibits+experimental+choroidal+neovascularization.">Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).</li><li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization:+nomenclature+and+experimental+guidelines.">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li><li>Liyanage, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+inflammatory+and+resident+myeloid+populations+in+mouse+ocular+inflammatory+models.">Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models.</a> Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).</li><li>Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cell+Suspensions+Isolated+from+Solid+Tissues+by+Spectral+Flow+Cytometry.">Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A citometria de fluxo de vários parâmetros permite a análise quantitativa de múltiplos tipos de células em um tecido complexo. Neste relatório, descrevemos a detecção citométrica de fluxo de populações de fagocitos mononucleares, incluindo monócitos, células dendríticas e subconjuntos de macrófagos, após lesão a laser no olho do rato. Liyanage et al relataram recentemente uma estratégia semelhante de gating para detectar neutrófilos, eosinófilos, linfócitos, DCs, macrófagos, macrófagos infiltrados ...

O sistema imunológico inato inclui múltiplos tipos de células que estimulam a ativação e inflamação complementares. As células imunes inatas incluem células assassinas naturais (NK), células de mastro, basófilos, eosinófilos, neutrófilos e fagocitos mononucleares. Os fagocitos mononucleares, compostos por monócitos, macrófagos e células dendríticas, foram implicados na fisiopatologia de múltiplas condições oftálmicas, incluindo uveíte, retinopatia diabética e degeneração macular relacionada à idade (AMD)1. Neste protocolo, focaremos na identificação de faócitos mononucleares utilizando análises citométricas de fluxo de vários parâmetros em um modelo de mouse de AMD neovascular2. Este protocolo é adaptável para modelos de camundongos de retinopatia diabética e/ou uveíte, mas a dissecção ocular mais extensa é recomendada devido à natureza sistêmica dessas doenças.
Os fagocitos mononucleares expressam marcadores de superfície de células sobrepostos. Os macrófagos residentes de tecido de longa duração e a microglia são originários do progenitor de células eritrolóides derivados da gema3,enquanto a reciclagem de macrófagos e células dendríticas se diferenciam do progenitor de células dendríticas derivados da medula óssea4. Os marcadores de superfície de células do rato comuns a monócitos, macrófagos e células dendríticas incluem CD45, CD11b5, F4/806,Cx3cr17e o marcador intracelular Iba18. Para superar esse desafio, a análise transcriômica de macrófagos, monócitos e células dendríticas de múltiplos tecidos define CD64 como um marcador de superfície celular específico para macrófago6. Macrófagos foram descritos na íris, corpo ciliar, ciliar e nervo óptico em olhos saudáveis3. Alternativamente, a identificação de células dendríticas é mais difícil; o método mais específico de identificação celular dendrítica requer mapeamento do destino usando o mouse repórter Zbtb46-GFP9. Independente desta linha de repórteres, a expressão de CD11c e MHCII em conjunto com a ausência de CD64 pode identificar potenciais células dendríticas6,10. Células dendríticas foram identificadas em córnea, conjuntiva, íris e coroide em olhos normais11. Microglia são macrófagos especializados localizados na retina, protegidos pela barreira hemrateira-retina, e derivados de células progenitoras do sac gema12. Como resultado, a microglia da retina pode ser diferenciada dos macrófagos derivados de monócitos por seus níveis fracos de expressão CD4513 e altos níveis de Tmem119, que está disponível como anticorpo citometria de fluxo14. Após a ativação da microglia, no entanto, o CD45 pode ser regulado15 e O Tmem119 pode ser regulado3, demonstrando a complexidade da biologia da microglia e isso é provavelmente relevante tanto na AMD quanto em seu modelo de mouse. Finalmente, os monócitos podem ser divididos em pelo menos dois subtipos, incluindo clássico e não clássico. Monócitos clássicos exibem ccr2+Ly6Caltabaixa expressão CX3CR1, e monócitos não clássicos demonstram CCR2-Ly6CbaixoCX3CR1marcadores altos 5.
Devido à necessidade da análise quantitativa da expressão marcadora, ou seja, níveis altos versus baixos/fracos, a citometria de fluxo de vários parâmetros é o método ideal para a discriminação entre monócitos, macrófagos, microglia e células dendríticas no olho e outros tecidos. Outras vantagens incluem a identificação de sub populações, a capacidade de usar a triagem celular ativada por fluorescência (FACS) para classificar populações celulares para análise transcriômica ou proteômica e mapeamento do destino. A maior desvantagem da citometria de fluxo de vários parâmetros é a falta de arquitetura tecidual. Isso pode ser superado pela dissecção oftálmica nos diversos subcoentamentos oculares: córnea, conjuntiva, íris, lente, retina e complexo coroide-esclera. Além disso, a imagem confirmatória de imunofluorescência pode ser realizada, mas é limitada pelo número de marcadores e falta de quantitação robusta.
Estudos de associação de genomas associaram múltiplos genes complementares com a AMD16. A ativação complementar leva à produção de anafilatoxinas, recrutamento de leucócitos e inflamação resultante. Em camundongos deficientes receptores complementares, a lesão a laser reduz o recrutamento de fagocitos mononucleares e a área de neovascularização choroidal induzida por laser (CNV)17. Da mesma forma, o camundongo c-c 2 (CCR2), que é deficiente no recrutamento de monócitos para o tecido, demonstra tanto a diminuição do recrutamento de faócitos mononucleares quanto a área cnv induzida por laser18. Esses dados ligam complementos e fagocitos mononucleares com CNV experimental e possivelmente AMD neovascular. Em apoio a esta associação, os receptores complementares são desregulados em monócitos sanguíneos periféricos em pacientes com AMD neovascular19,20. Esses dados demonstram forte associação entre os faócitos AMD e mononucleares.
Neste manuscrito, usaremos o modelo experimental de CNV induzido a laser para caracterizar as populações de fagocites mononucleares no olho do rato usando citometria de fluxo de vários parâmetros. CnV induzida a laser é o modelo padrão do mouse da AMD neovascular, que demonstrou a eficácia da terapia de AMD neovascular de primeira linha atual21. Este protocolo descreverá a enucleação dos olhos do rato, dissecção ocular, digestão em uma única suspensão celular, coloração de anticorpos, determinação de tensões a laser usando controles de cor única e estratégia de gating usando controles de fluorescência menos um (FMO). Para obter uma descrição detalhada do modelo CNV induzido por laser, consulte uma publicação anterior22. Usando este protocolo, definiremos microglias, monócitos, células dendríticas e populações de macrófagos. Além disso, usaremos MHCII e CD11c para definir ainda mais subconjuntos de macrófago dentro do modelo CNV induzido a laser.

<table><tbody><tr><td>0.6 ml microcentrifuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>1.7 ml microcentrifuge tubes</td><td>Costar</td><td>3620</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>431031</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conicals</td><td>ThermoFisher</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS, 500 ml</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>2.5 ml syringe</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>7886-1</td><td></td></tr><tr><td>20% paraformaldehyde solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713-S</td><td></td></tr><tr><td>25 ml pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>431032</td><td></td></tr><tr><td>30 G needle</td><td>Exel</td><td>26437</td><td></td></tr><tr><td>3ml luer lock syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955457</td><td></td></tr><tr><td>41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-112</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conicals</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96-well, U-bottom assay plate without lid</td><td>Falcon</td><td>353910</td><td></td></tr><tr><td>Amine reactive beads</td><td>ThermoFisher</td><td>A10628</td><td></td></tr><tr><td>Analysis software</td><td>FlowJo</td><td>v 10</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set</td><td>BD Biosciences</td><td>552845</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Cell counter</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Cell counter slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Compensation beads</td><td>ThermoFisher</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>Count beads</td><td>ThermoFisher</td><td>01-1234-42</td><td></td></tr><tr><td>Curved forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-123</td><td></td></tr><tr><td>Digestion enzyme</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>National Optical and Scientific Instruments, Inc.</td><td>DC3-420T</td><td></td></tr><tr><td>Dissociation tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Electronic dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-937</td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Integra Miltex</td><td>17035X</td><td></td></tr><tr><td>Flow buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow tubes</td><td>Falcon</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Hamster anti-mouse CD11c BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562782</td><td></td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-123</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead dye</td><td>ThermoFisher</td><td>65-0866-14</td><td></td></tr><tr><td>Lysing solution, 10x solution</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Micro titer tube and rack</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-380</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-mouse CD64 PE</td><td>BioLegend</td><td>139304</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562864</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipet tips</td><td>Denville Scientific</td><td>P2404</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipettor</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>P2 pipet tips</td><td>eppendorf</td><td>22491806</td><td></td></tr><tr><td>P2 pipettor</td><td>Gilson</td><td>FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>P20 pipettor</td><td>Gilson</td><td>FA10003M</td><td></td></tr><tr><td>P200 pipet tips</td><td>Denville Scientific</td><td>P2401</td><td></td></tr><tr><td>P200 pipettor</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>Pipet man</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB14955202</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse B220 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562313</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557657</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700</td><td>BD Biosciences</td><td>557958</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD19 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>553786</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD4 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562314</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD45 FITC</td><td>ThermoFisher</td><td>11-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>552848</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD8 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562315</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Ly6C</td><td>BD Biosciences</td><td>561085</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Ly6G PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562700</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700</td><td>BioLegend</td><td>107622</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Siglec F PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562757</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647</td><td>BD Biosciences</td><td>564178</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator</td><td>Labnet</td><td>311DS</td><td></td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Sterile water, 500 ml</td><td>Gibco</td><td>A12873-01</td><td></td></tr><tr><td>Swinging bucket centrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5910 R</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue, 0.4% solution</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

digestion of whole mouse eyes for multi-parameter flow cytometric analysis of mononuclear phagocytes

O sistema imunológico inato desempenha papéis importantes na fisiopatologia ocular, incluindo uveíte, retinopatia diabética e degeneração macular relacionada à idade. As células imunes inatas, especificamente os faócitos mononucleares, expressam marcadores de superfície celular sobrepostos, o que torna a identificação dessas populações um desafio. A citometria de fluxo de vários parâmetros permite a análise quantitativa simultânea de marcadores de superfície de múltiplas células, a fim de diferenciar monócitos, macrófagos, microglia e células dendríticas nos olhos do rato. Este protocolo descreve a enucleação de olhos inteiros do rato, dissecção ocular, digestão em uma única suspensão celular e coloração da suspensão de célula única para marcadores de células mielóides. Além disso, explicamos os métodos adequados para determinar tensões usando controles de cor única e para delinear portões positivos usando fluorescência menos um controles. A maior limitação da citometria de fluxo de vários parâmetros é a ausência de arquitetura tecidual. Essa limitação pode ser superada pela citometria de fluxo de vários parâmetros de compartimentos oculares individuais ou coloração de imunofluorescência complementar. No entanto, a imunofluorescência é limitada pela sua falta de análise quantitativa e pelo número reduzido de fluoroforos na maioria dos microscópios. Descrevemos o uso de citometria de fluxo multiparamétrico para fornecer análises altamente quantitativas de fagocitos mononucleares na neovascularização choroidal induzida por laser. Além disso, a citometria de fluxo de vários parâmetros pode ser usada para a identificação de subconjuntos de macrófagos, mapeamento de destinos e classificação celular para estudos transcriômicos ou proteômicos.

A Figura 1 mostrou histogramas de frequência não compensados para os SCCs e células para o laser vermelho: Alexa647, Alexa700 e APC-Cy7. Na Figura 1A,a linha magenta retratou o pico do CCS para Alexa647, enquanto a linha ciano mostrou a diferença de log pretendida de 0,5. Observe que o pico em Alexa700 e APC-Cy7 foi à esquerda (menos brilhante) da linha ciano. Note também que as células estavam todas à esquerda da linha magenta. As células à direita do...

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Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

Digestão de olhos inteiros de rato para análise citométrica de fluxo multi-parameter de fagocitos mononucleares

Este protocolo fornece um método para digerir olhos inteiros em uma única suspensão celular com o propósito de análise citométrica de fluxo de vários parâmetros, a fim de identificar populações fagocíticas mononucleares específicas, incluindo monócitos, microglia, macrófagos e células dendríticas.

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. ...

digestion-whole-mouse-eyes-for-multi-parameter-flow-cytometric

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

4.9K visualizações.  Northwestern University. Este protocolo fornece um método para digerir olhos inteiros em uma única suspensão celular com o propósito de análise citométrica de fluxo de vários parâmetros, a fim de identificar populações fagocíticas mononucleares específicas, incluindo monócitos, microglia, macrófagos e células dendríticas.

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Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

Enucleação Rato Olho para fenotipagem de alta capacidade remota

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Medicina

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

Whole Mount coloração de imunofluorescência do Rato Retina Neonatal para investigar angiogênese<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Neurociência

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and subsequently digests this material, commonly through lysosomal degradation. Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) whose phagocytic function has been described in a broad range of conditions from neurodegenerative disease (e.g., beta-amyloid clearance in Alzheimer&#8217;s disease) to development of the healthy brain (e.g., synaptic pruning)1-6. The following protocol is an engulfment assay developed to visualize and quantify microglia-mediated engulfment of presynaptic inputs in the developing mouse retinogeniculate system7. While this assay was used to assess microglia function in this particular context, a similar approach may be used to assess other phagocytes throughout the brain (e.g., astrocytes) and the rest of the body (e.g., peripheral macrophages) as well as other contexts in which synaptic remodeling occurs (e.g. ,brain injury/disease).

Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) with a high capacity to phagocytose or engulf material in their extracellular environment. Here, a broadly applicable, reliable, and highly quantitative assay for visualizing and measuring microglia-mediated engulfment of synaptic components is described.

Uma imersão Ensaio: Um protocolo para avaliar Interações entre CNS fagócitos e Neurônios

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

Avaliando Retinal microglia fagocítica Função<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando um ensaio baseado em citometria de fluxo

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Imunologia e Infecção

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main macrophage populations in the CNS: (i) the microglia, which are the resident macrophages of the CNS and are derived from yolk sac progenitors during embryogenesis, and (ii) the monocyte-derived macrophages (MDM), which can infiltrate the CNS during disease and are derived from bone marrow progenitors. The roles of each macrophage subpopulation differ depending on the pathology being studied. Furthermore, there is no consensus on the histological markers or the distinguishing criteria used for these macrophage subpopulations. However, the analysis of the expression profiles of the CD11b and CD45 markers by flow cytometry allows us to distinguish the microglia (CD11b+CD45med) from the MDM (CD11b+CD45high). In this protocol, we show that the density gradient centrifugation and the flow cytometry analysis can be used to characterize these CNS macrophage subpopulations, and to study several markers of interest expressed by these cells as we recently published. Thus, this technique can further our understanding of the role of macrophages in mouse models of neurological diseases and can also be used to evaluate drug effects on these cells.

This protocol provides an analysis of the macrophage subpopulations in the adult mouse central nervous system by flow cytometry and is helpful for the study of multiple markers expressed by these cells.

Análise de Microglia e Macropagos derivados de Monócitos do Sistema Nervoso Central por Citometria de Fluxo

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

Quantificar o humano Monocyte Chemotaxis In Vitro e linfócitos murino tráfico Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

<meta charset="utf8"></head><body>Visualização de pericitos retinianos usando limpeza de tecidos e marcação fluorescente

3D Visualization of Retinal Vascular Pericytes in Mice by Immunostaining 

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal vasculature. To provide a detailed view of the morphological characteristics of pericytes, this study described a new approach combining the retro-orbital injection of a fluorescent agent, immunofluorescent-staining, and tissue-clearing treatment. Firstly, the fluorescent tomato lectin was injected into the retro-orbital sinus of the live mouse to label the retinal vasculature. After 5 min, the mouse was sacrificed, and its intact retina was carefully removed from the retinal cup and immunofluorescently stained with platelet-derived growth factor receptor &#946; to reveal the pericytes. Additionally, the stained retina was treated with tissue-clearing reagent and whole mounted on the microscope slide. Through these approaches, the retinal vasculature and pericytes were clearly observed in the transparent retina. Under a confocal microscope, we obtained more opportunities to take high-resolution images for further reconstructing and analyzing the morphological characteristics of pericytes along the retinal vascular tree in a three-dimensional view. Methodologically, this protocol offers an effective approach for visualizing pericytes within the retinal vasculature, providing valuable insights into their role under both physiological and pathological conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Visualização 3D de pericitos vasculares da retina em camundongos por imunocoloração

The pericytes in retinal vasculature were examined by immunofluorescent staining with platelet-derived growth factor receptor &#946; after retro-orbital injection of fluorescent tomato lectin. The labeled retina was further treated with the tissue-clearing method and whole mounted for visualizing the three-dimensional views of pericytes surrounding retinal vasculature under a confocal microscope.

Visualização 3D de pericitos vasculares da retina em camundongos por imunocoloração 

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal ...

Bioquímica

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Time-Lapse imagem em 3D da fagocitose por macrófagos de rato

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Digestão de olhos inteiros de rato para análise citométrica de fluxo multi-parameter de fagocitos mononucleares

Resumo

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Visualização 3D de pericitos vasculares da retina em camundongos por imunocoloração

Visualização 3D de pericitos vasculares da retina em camundongos por imunocoloração

Visualização 3D de pericitos vasculares da retina em camundongos por imunocoloração

Time-Lapse imagem em 3D da fagocitose por macrófagos de rato