Este trabajo fue apoyado por NIA R00 AG053412 (KEF).

Todos los procedimientos se realizaron de conformidad con las recomendaciones de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud y de acuerdo con los Principios Rectores Internacionales para la Investigación Biomédica con Animales. El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Norte en Charlotte (Protocolo #19-020).
1. Prepararse para la cultura
NOTA: Estos procedimientos deben realizarse en condiciones estériles en un gabinete de bioseguridad designado para cultivo de tejidos. Consulte la Tabla 1 para ver los medios y las soluciones.
<ol><li>Esterilice todas las herramientas de disección mediante autoclave en bolsas de esterilización autoselladas.</li>
	<li>Prepare las existencias de trabajo de poli-D-lisina para el tratamiento de platos de cultivo de 12 pozos.<ol>
<li>Disolver la poli-D-lisina en 1x tampón de borato a una concentración de 100 μg/mL (10x concentrado). Guarde aproximadamente 1 mL de alícuotas a -20 °C hasta que sea necesario.</li>
		<li>Diluir 10x poli-D-lisina concentrada en dPBS a 10 μg/mL (1x) y filtrar esterilizar.</li>
		<li>Trate las placas de cultivo de 12 pocillos con 0.5 mL por pocillo de 1x poli-D-lisina a temperatura ambiente durante al menos 1 h o durante la noche para usar al día siguiente. Asegúrese de que el volumen de poli-D-lisina es suficiente para cubrir completamente la parte inferior del área de cultivo.</li>
		<li>Justo antes del uso, retire la poli-D-lisina de la placa de cultivo, enjuague 3 veces en agua estéril y manténgala en agua estéril hasta que esté lista para platear las células. Retire todos los rastros de líquido por una aspiración completa antes de enchapado de las células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare los medios de crecimiento de la neurona y el búfer FACS. Filtrar esterilizar y conservar a 4 °C hasta su uso. Medios de crecimiento de la neurona se pueden mantener durante aproximadamente 2 wks; El búfer FACS se puede mantener durante aproximadamente 4 wks.</li>
</ol>2. Disección del hipocampo embrionario
NOTA: Este procedimiento se puede realizar en la sobremesa ya que requiere el uso de un microscopio estéreo para la eliminación de meninges y microdisección del hipocampo. Adherirse a la técnica aséptica estricta para minimizar la contaminación potencial.
<ol><li>Eutanasiar a una hembra de ratón C57BL/6J embarazada cronometerada en el día embrionario 18 en una cámara de CO2.</li>
	<li>Rocíe la piel abdominal y la piel con 70% de EtOH, luego pellizque la piel con fórceps de tejido y haga una pequeña incisión con tijeras quirúrgicas. Incise el peritoneo para exponer las vísceras y el útero.</li>
	<li>Agarre el útero con las autonujeras de patrón estándar, elebre fuera de la cavidad y corte la conexión con el mesometrium con unas tijeras finas. Transferir el útero con embriones a 100 mm de plato de cultivo plástico estéril colocado sobre hielo.</li>
	<li>Usando tijeras finas y lórceps finos, corte cuidadosamente el útero y extraiga los sacos embrionarios para liberar embriones. Transferir embriones a un nuevo plato de cultivo de plástico estéril de 100 mm que contenga dPBS colocado en hielo.</li>
	<li>Decapitar cachorros embrionarios usando tijeras finas y transferir cabezas a un nuevo plato de cultivo de plástico estéril de 100 mm que contiene el medio Hibernate-E colocado en el hielo.</li>
	<li>Para extirpar el cerebro, sostenga la cabeza con un par de pórceps finos en una mano. Usando dumont curvo #7 fórceps en otra mano, inserte la punta de las pinzas en la base del cráneo y pellizque el hueso y la piel sobrepuesto moviéndose anterior a lo largo de la línea media sin perforar el cerebro.</li>
	<li>El uso de fórceps curvos separa la piel y el cráneo para exponer el cerebro. Barrer las fórceps curvas debajo del cerebro desde el bulbo olfatorio expuesto hasta el cerebelo para levantar el cerebro del cráneo. Transfiera el cerebro a un nuevo plato de cultivo de plástico estéril de 100 mm que contenga el medio Hibernate-E colocado en el hielo. Repita para cada cerebro. NOTA: Todos los cerebros pueden ser recogidos en un solo plato de cultivo a menos que sea necesario estar separado para fines específicos del experimento.</li>
	<li>Bajo un microscopio de disección estéreo, trabajando con un cerebro a la vez y dos pares de dumont estériles #5 pinzas, pellizcar los bulbos olfativos y alejar las meninges. El retiro cuidadoso de las meninges es necesario evitar la contaminación de la cultura por otras células y permitir la disección adicional.</li>
	<li>Una vez que las meninges se eliminan correctamente, el lado superior de la corteza se abre lateralmente, lo que expondrá el hipocampo. Usando Dumont #5 fórceps, pellizcar el hipocampo lejos de la corteza unida, y transferir cuidadosamente el hipocampo aislado a un tubo cónico estéril de 15 mL que contiene 5 mL de medio Hibernate-E en el hielo.</li>
	<li>Repita la disección para ambos hemisferios cerebrales para cada cachorro de ratón embrionario y combine todos los hipocampos en un solo tubo cónico de 15 mL, a menos que sea necesario por separado para fines específicos del experimento.<ol>
<li>Para cultivar neuronas corticales, la corteza puede separarse de la subcorteza y procesarse de forma idéntica a las neuronas del hipocampo. Nota : en este momento, el protocolo puede estar en pausa. Almacenar cerebros o hipocampos disecados en medio Hibernate-E suplementado con B27 (2%) a 4 °C durante un máximo de 1 mes, aunque el retraso prolongado puede comprometer el número de células viables.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Disociar y cultivar las neuronas del hipocampo
NOTA: Todos los procedimientos deben realizarse en condiciones estériles en un gabinete de bioseguridad designado cultivo de tejidos.
<ol><li>Preparar 0,5 mL de solución de disociación de papaína por embrión para la disociación del hipocampo. El volumen de solución de disociación necesaria variará dependiendo del número de cerebros embrionarios que se diseccionen. NOTA: Para el cultivo de neuronas corticales, prepare 1,0 mL de solución de papaína por embrión.<ol>
<li>Disolver 20 μL de suspensión de papaína por 1 mL del medio Hibernate E por vórtice durante aproximadamente 3 min.</li>
		<li>Después de disolver la papaína, añadir 1 μL de DNasa I por 1 mL de la solución. No vórtice la solución después de que se haya añadido DNasa I, ya que esto puede desactivar la enzima.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrífuga 15 mL tubo cónico que contiene tejido hipocampal (paso 2.10) a 1, 000 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y agregue la solución de papaína. Resuspend el tejido invirtiendo varias veces. Incubar a 37 °C durante 30 min, invirtiendo para resuspend el tejido cada 10 min.<ol>
<li>Si cultiva neuronas corticales, transfiera todas las cortezas a un nuevo plato de cultivo estéril de 100 mm, aspire cuidadosamente los medios del plato y el tejido picado con tijeras finas o cuchilla de afeitar. Añadir solución de papaína al plato de cultivo y transferir tejido cortical con solución de papaína a 15 mL de tubo cónico utilizando una pipeta de transferencia estéril. Incubar tejido y solución enzimática a 37 °C durante 30 min, agitando cada 10 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Durante 30 min de incubación, prepare 3 pipetas Pasteur de vidrio pulido al fuego: 1 completamente abierto, 1 medio abierto y 1 cuarto abierto.</li>
	<li>Después de la incubación de 30 minutos, centrífuga el tubo cónico de 15 mL que contiene tejidos cerebrales digeridos en 125 x g por el minuto 10. Retire la solución enzimática y reemplácela con un volumen igual de medio hibernado E fresco.</li>
	<li>Usando pipeta Pasteur completamente abierta, triturar el tejido 10x. Deje que el tejido se asiente durante 2 minutos, luego transfiera la suspensión de células sobrenadantes a un tubo cónico estéril de 50 mL. Agregue un volumen igual de medio Hibernate E de nuevo al tejido.</li>
	<li>Usando pipeta Pasteur sesabierta, triturar el tejido 10x. Deje que el tejido se asiente durante 2 minutos, luego transfiera la suspensión de células sobrenadantes al mismo tubo cónico de 50 mL que en el paso anterior. Agregue un volumen igual de medio Hibernate E de nuevo al tejido.</li>
	<li>Usando pipeta Pasteur cuarto abierto, triturar el tejido 10x. Deje que el tejido se asiente durante 2 minutos, luego transfiera la suspensión de células sobrenadantes nuevamente a los mismos 50 mL cónicos que en pasos anteriores. Deseche cualquier tejido restante que no se haya disociado.</li>
	<li>Centrifugar el tubo cónico de 50 mL que contiene el sobrenadante de la suspensión celular a 125 x g durante 5 min. Si aún no lo ha hecho, lave las placas recubiertas de poli-D-lisina con agua estéril y elimine todos los rastros de líquido por aspiración completa durante la centrifugación.</li>
	<li>Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y resuspend el pellet celular en 5 mL de medios de crecimiento de neuronas. Cuente las células vivas usando el azul del trypan y el hemocytometer.<ol>
<li>Si cultiva neuronas corticales, agregue al menos 10 mL de medios de crecimiento neuronal para células menos densas y un conteo más preciso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diluya las células con medios de crecimiento neuronal para una densidad de revestimiento final de 5 x 105 células viables por ml y agregue 1 mL de suspensión de células diluidas a cada pozo de una placa de 12 pozos. Mantener las neuronas a 37 °C con un 5% deCO2. NOTA: Típicamente, los hipocampos de 1 cerebro de ratón embrionario, es decir, 2 hipocampos, producen aproximadamente 1 x 106 células viables. Este número se proporciona únicamente con fines de planificación de experimentos y no debe considerarse una sustitución para contar las celdas de cada cultivo.</li>
	<li>Cambie el medio de crecimiento al día siguiente del cultivo eliminando la mitad del volumen de medios de cada pozo, es decir, 0,5 mL, y agregue un volumen igual de medios frescos al lado del pozo para evitar interrumpir las células cultivadas. La mitad completa de los medios cambia dos veces por semana para la vida útil de la cultura.</li>
</ol>4. Evaluación de la expresión de MHCI por citometría de flujo
<ol><li>Preparar el tratamiento diluyendo interferón beta (IFNβ) o un volumen igual de diluyente en medios de crecimiento neuronal. Dado que el cambio de medios será un cambio de medio volumen, prepare medios de tratamiento con 2x IFNβ concentrado. es decir, para tratar 3 pozos de una placa de 12 pozos con 100 U/mL de IFNβ, preparar 1,5 mL con 200 U/mL ifnβ o un volumen igual de diluyente IFNβ para controles tratados con medios.</li>
	<li>Retire 0.5 mL de cada pozo de neuronas y agregue 0.5 mL de medios de crecimiento neuronal con o sin IFNβ a cada pozo. Incubar en condiciones normales de crecimiento (37 °C, 5% co2)durante 6-72 h, dependiendo de las condiciones experimentales y la optimización de la señal.</li>
	<li>Después del tiempo de tratamiento, retire todos los medios de cultivo y lave suavemente una vez en medios neurobasales fríos que carecen de suplementos (B27, L-glutamina, Pen-Strep).</li>
	<li>Añadir 0,5 mL de medio neurobasal frío no suplementado que contenga 1 μg/mL de bloque Fc y 1 μg/mL de anticuerpo anti-MHCI conjugado fluorescente a cada pozo. Incubar a 4 °C protegido de la luz durante 45 min.</li>
	<li>Retire los medios que contienen anticuerpos y lave cuidadosamente una vez en frío dPBS. Agregue 0,5 mL de tampón de disociación celular libre de enzimas a temperatura ambiente a cada pozo y agitar para desalojar las células. Esté atento a la disociación usando el microscopio de cultivo de tejido invertido.</li>
	<li>Una vez que las células se separan del plato de cultivo, agregue 0.5 mL de tampón FACS a cada pocillo, triturar las células para dispersar los grupos y transferir el volumen total de cada pocillo a tubos individuales de microcentrífuga de 1.7 mL.</li>
	<li>Centrífuga a 1, 000 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante, resuspend el pellet de la célula en 100 μL de tampón FACS, y transfiera el volumen total de cada tubo a los pozos individuales de una placa de fondo en U de 96 pozos.</li>
	<li>Agregue 100 μL de reactivo fijador a cada pozo. Triturar varias veces para evitar que las células se agrupen e incubar durante 15 min a temperatura ambiente protegida de la luz.</li>
	<li>Centrífuga a 500 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y resuspend en 200 μl de búfer FACS.</li>
	<li>Centrífuga a 500 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y resuspend en 100 μL de reactivo de permeabilización que contiene anticuerpo anti-NeuN conjugado fluorescente (dilución 1:100) a cada pozo. Mezclar bien, luego incubar a temperatura ambiente protegido de la luz con balanceo durante 20 min.</li>
	<li>Después de la incubación, centrífuga a 500 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a resuspend en 100 μL de búfer FACS. Repetir 2x.</li>
	<li>Después del lavado final, resuspend las células en 100 μL de paraformadehído al 2% diluidas en tampón FACS. Mezcle bien para evitar que las células se agrupe. Conservar a 4 °C protegido de la luz hasta que esté listo para leer en un citómetro de flujo. Lea las muestras tan pronto como sea posible, dentro de 1 semana.</li>
</ol>5. Cuantificación y evaluación de datos
<ol><li>Mida los controles de compensación para cada tinte fluorescente y corrija cualquier superposición espectral. Los controles de compensación ideales incluyen neuronas cultivadas que no están manchadas, teñidas con anti-MHCI solamente, y manchadas con anti-NeuN solamente.</li>
	<li>Si es posible, registre 100.000 eventos para cada muestra (al menos 10.000) y guárdelos como archivos FCS.</li>
	<li>Para analizar los datos, utilizando el software de análisis adecuado, configure puertas secuenciales, como se muestra en la Figura 1A-C para seleccionar las neuronas NeuN-positivas.<ol>
<li>Gráfica SSC-A (logaritmo) vs FSC-A (lineal). Dibuje una puerta en la población celular (P1) para eliminar los desechos celulares del análisis.</li>
		<li>Dentro de la población celular P1, gráfica FSC-H (lineal) vs FSC-A (lineal). Dibuje una puerta en la población unicelular.</li>
		<li>Dentro de la población unicelular, trace SSC-A (log) vs NeuN (log). Dibuje una puerta en la población NeuN-positiva usando las células manchadas sin manchar o MHCI-solamente como guía.</li>
		<li>Trace un histograma de fluorescencia MHCI con eventos celulares normalizados al modo en el eje Y. Usando neuronas no manchadas o teñidas solo de NeuN como guía, dibuje una puerta horizontal para cuantificar el porcentaje de neuronas positivas para MHCI.</li>
		<li>Exporte el porcentaje de células positivas para MHCI, así como la mediana de intensidad de fluorescencia (IMF) para MHCI en la población NeuN-positiva para evaluación estadística y dibujo gráfico.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Galea, I., Bechmann, I., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+immune+privilege+(not).">What is immune privilege (not).</a> Trends in Immunology. 28 (1), 12-18 (2007).</li><li>Morimoto, K., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Immune+System+in+the+Development+of+the+Central+Nervous+System.">Role of the Immune System in the Development of the Central Nervous System.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 916 (2019).</li><li>Klein, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+During+RNA+Viral+Infections.">Neuroinflammation During RNA Viral Infections.</a> Annual Review of Immunology. 37, 73-95 (2019).</li><li>Janeway, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T+cell+receptor+as+a+multicomponent+signalling+machine:+CD4/CD8+coreceptors+and+CD45+in+T+cell+activation.">The T cell receptor as a multicomponent signalling machine: CD4/CD8 coreceptors and CD45 in T cell activation.</a> Annual Review of Immunology. 10, 645-674 (1992).</li><li>Peaper, D. R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+MHC+class+I+assembly+and+peptide+binding.">Regulation of MHC class I assembly and peptide binding.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 24, 343-368 (2008).</li><li>Donaldson, J. G., Williams, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Assembly+and+Trafficking+of+MHC+Class+I+Molecules.">Intracellular Assembly and Trafficking of MHC Class I Molecules.</a> Traffic. 10 (12), 1745-1752 (2009).</li><li>Charles, A., Janeway, J., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell-mediated+cytotoxicity.">T cell-mediated cytotoxicity.</a> Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition. , (2001).</li><li>Guidotti, L. G., Chisari, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncytolytic+control+of+viral+infections+by+the+innate+and+adaptive+immune+response.">Noncytolytic control of viral infections by the innate and adaptive immune response.</a> Annual Review of Immunology. 19, 65-91 (2001).</li><li>Chevalier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+are+MHC+class+I-dependent+targets+for+CD8+T+cells+upon+neurotropic+viral+infection.">Neurons are MHC class I-dependent targets for CD8 T cells upon neurotropic viral infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (11), 1002393 (2011).</li><li>Shrestha, B., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CD8++T+Cells+in+Control+of+West+Nile+Virus+Infection.">Role of CD8+ T Cells in Control of West Nile Virus Infection.</a> Journal of Virology. 78 (15), 8312-8321 (2004).</li><li>Plaisted, W. C., Weinger, J. G., Walsh, C. M., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+mediated+suppression+of+neurotropic+coronavirus+replication+in+neural+precursor+cells.">T cell mediated suppression of neurotropic coronavirus replication in neural precursor cells.</a> Virology. 449, 235-243 (2014).</li><li>Marten, N. W., Stohlman, S. A., Zhou, J., Bergmann, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+virus-specific+CD8++-T-cell+expansion+and+trafficking+following+central+nervous+system+infection.">Kinetics of virus-specific CD8+ -T-cell expansion and trafficking following central nervous system infection.</a> Journal of Virology. 77 (4), 2775-2778 (2003).</li><li>Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+I:+an+unexpected+role+in+neuronal+plasticity.">MHC class I: an unexpected role in neuronal plasticity.</a> Neuron. 64 (1), 40-45 (2009).</li><li>Corriveau, R. A., Huh, G. S., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+class+I+MHC+gene+expression+in+the+developing+and+mature+CNS+by+neural+activity.">Regulation of class I MHC gene expression in the developing and mature CNS by neural activity.</a> Neuron. 21 (3), 505-520 (1998).</li><li>Goddard, C. A., Butts, D. A., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CNS+synapses+by+neuronal+MHC+class+I.">Regulation of CNS synapses by neuronal MHC class I.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (16), 6828-6833 (2007).</li><li>Needleman, L. A., Liu, X. B., El-Sabeawy, F., Jones, E. G., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+I+molecules+are+present+both+pre-+and+postsynaptically+in+the+visual+cortex+during+postnatal+development+and+in+adulthood.">MHC class I molecules are present both pre- and postsynaptically in the visual cortex during postnatal development and in adulthood.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (39), 16999-17004 (2010).</li><li>Syken, J., Grandpre, T., Kanold, P. O., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PirB+restricts+ocular-dominance+plasticity+in+visual+cortex.">PirB restricts ocular-dominance plasticity in visual cortex.</a> Science. 313 (5794), 1795-1800 (2006).</li><li>Atwal, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PirB+is+a+functional+receptor+for+myelin+inhibitors+of+axonal+regeneration.">PirB is a functional receptor for myelin inhibitors of axonal regeneration.</a> Science. 322 (5903), 967-970 (2008).</li><li>Takai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+immunoglobulin-like+receptors+and+their+MHC+class+I+recognition.">Paired immunoglobulin-like receptors and their MHC class I recognition.</a> Immunology. 115 (4), 433-440 (2005).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+elimination+and+learning+rules+co-regulated+by+MHC+class+I+H2-Db.">Synapse elimination and learning rules co-regulated by MHC class I H2-Db.</a> Nature. 509 (7499), 195-200 (2014).</li><li>Ribic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+regulation+of+MHC+class+I+expression+in+the+developing+primary+visual+cortex+of+the+common+marmoset+monkey.">Activity-dependent regulation of MHC class I expression in the developing primary visual cortex of the common marmoset monkey.</a> Behavioral and Brain Functions. 7, 1 (2011).</li><li>Sahu, M. P., Nikkil&#228;, O., L&#229;gas, S., Kolehmainen, S., Castr&#233;n, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+primary+neurons+from+rat+hippocampus+and+cortex.">Culturing primary neurons from rat hippocampus and cortex.</a> Neuronal Signaling. 3 (2), (2019).</li><li>Gordon, J., Amini, S., White, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+overview+of+neuronal+cell+culture.">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).</li><li>Zhang, X., Hu, D., Shang, Y., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+induced+pluripotent+stem+cell+neuronal+models+to+study+neurodegenerative+diseases.">Using induced pluripotent stem cell neuronal models to study neurodegenerative diseases.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1866 (4), 165431 (2020).</li><li>Berry, B. J., Smith, A. S. T., Young, J. E., Mack, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+Current+Challenges+Associated+with+the+Use+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Modeling+Neurodegenerative+Disease.">Advances and Current Challenges Associated with the Use of Human Induced Pluripotent Stem Cells in Modeling Neurodegenerative Disease.</a> Cells, Tissues, Organs. 205 (5-6), 331-349 (2018).</li><li>Ho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Single-Cell+Transcriptomics+in+Adult+Rodent+Brain:+The+Medium+Spiny+Neuron+Transcriptome+Revisited.">A Guide to Single-Cell Transcriptomics in Adult Rodent Brain: The Medium Spiny Neuron Transcriptome Revisited.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 159 (2018).</li><li>Panchision, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Flow+Cytometric+Analysis+of+Central+Nervous+System+Tissue+Reveals+Novel+Functional+Relationships+Among+Cells+Expressing+CD133,+CD15,+and+CD24.">Optimized Flow Cytometric Analysis of Central Nervous System Tissue Reveals Novel Functional Relationships Among Cells Expressing CD133, CD15, and CD24.</a> Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).</li><li>Snaidero, N., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+at+a+glance.">Myelination at a glance.</a> Journal of Cell Science. 127 (14), 2999-3004 (2014).</li><li>Martin, D., Xu, J., Porretta, C., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurocytometry:+Flow+Cytometric+Sorting+of+Specific+Neuronal+Populations+from+Human+and+Rodent+Brain.">Neurocytometry: Flow Cytometric Sorting of Specific Neuronal Populations from Human and Rodent Brain.</a> ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 356-367 (2017).</li><li>Lv, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+MHC+Class+I+Expression+Is+Regulated+by+Activity+Driven+Calcium+Signaling.">Neuronal MHC Class I Expression Is Regulated by Activity Driven Calcium Signaling.</a> PLoS One. 10 (8), 0135223 (2015).</li><li>Barco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+facilitated+L-LTP+in+VP16-CREB+mice+reveals+that+BDNF+is+critical+for+the+maintenance+of+LTP+and+its+synaptic+capture.">Gene expression profiling of facilitated L-LTP in VP16-CREB mice reveals that BDNF is critical for the maintenance of LTP and its synaptic capture.</a> Neuron. 48 (1), 123-137 (2005).</li><li>Glynn, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHCI+negatively+regulates+synapse+density+during+the+establishment+of+cortical+connections.">MHCI negatively regulates synapse density during the establishment of cortical connections.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 442-451 (2011).</li><li>Facci, L., Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Rodent+Cortical,+Hippocampal,+and+Striatal+Neurons.">Culture of Rodent Cortical, Hippocampal, and Striatal Neurons.</a> Methods Molecular Biology. 1727, 39-47 (2018).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe la disección y la cultura de neuronas hippocampal primarias de cachorros prenatales del ratón en el día embrionario 18. El uso de neuronas primarias cultivadas a partir de roedores es una de las metodologías más fundamentales desarrolladas en la neurobiología moderna22. Aunque las líneas celulares inmortalizadas pueden modelar ciertos aspectos de las neuronas, su naturaleza como células derivadas de tumores, la falta de desarrollo de axones definidos y la división celular continua plantean dudas sobre si recapitulan fielmente las propiedades de las neuronas post-mitóticas in vivo23. Otra alternativa a las neuronas primarias es el uso de células madre pluripotentes inducidas por humanos (HiPSCs). La tecnología para el uso de hiPSCs, especialmente aquellos que son derivados de pacientes, ha avanzado rápidamente en los últimos años24. Sin embargo, todavía existen limitaciones para trabajar con HiPSCs, incluyendo la variabilidad entre líneas celulares, la falta de madurez funcional y las diferencias en los perfiles epigenéticos25. Aunque también hay limitaciones para trabajar con el modelo reduccionista de las neuronas primarias de roedores, las neuronas cultivadas conservan la naturaleza post-mitótica de las neuronas in vivo. Además, las herramientas expansivas de biología molecular y las modificaciones genéticas disponibles para los ratones favorecen el uso de neuronas primarias sobre hiPSCs para muchas aplicaciones, y los estudios en ratones se pueden traducir fácilmente al organismo in vivo más complejo sin perder el sistema genético experimental. Por estas razones, muchos investigadores utilizan neuronas primarias de roedores para verificar aspectos clave, si no la mayor parte, de su investigación.
Para ciertos ensayos, las neuronas se pueden analizar directamente después del aislamiento del cerebro exvivo. Esto es particularmente deseable para experimentos con ratones adultos que pueden ser sometidos a condiciones experimentales específicas o que pueden depender de interacciones de múltiples tipos celulares; sin embargo, hay varias cuestiones que limitan el tipo de análisis que se pueden hacer. Es técnicamente difícil preparar una suspensión unicelular de neuronas de los cerebros de ratones adultos porque las neuronas están interconectadas y ensheadas de forma única por la mielina26. Los métodos no enzimáticos de trituración de tejidos son ineficientes para disociar el tejido y causar la muerte celular, mientras que las preparaciones enzimáticas a menudo escinden los antígenos de la superficie celular27. Además, mientras que la mielina está en gran parte ausente de los ratones embrionarios, comprende alrededor del 20% del cerebro adulto, y puede perjudicar el aislamiento celular viable e impedir el análisis de citometría de flujo28. Muchas de las técnicas que se han desarrollado en última instancia despojar a las neuronas de su citosol y dejar cuerpos celulares pequeños y redondeados que consisten principalmente en núcleos29. Aunque esto es aceptable para algunos análisis, esto no es apropiado para cuantificar la expresión de proteínas citoplasmáticas o extracelulares. Además, el sistema reduccionista de cultivo celular permite probar preguntas mecanicistas específicas en una escala de tiempo más corta de lo que es frecuentemente posible con un sistema in vivo.
También se describen en este protocolo los métodos para estimular la expresión de MHCI farmacológicamente con IFNβ, y la cuantificación de la expresión extracelular de MHCI por citometría de flujo. La estimulación por IFNβ es un control positivo útil para probar otras condiciones experimentales, pero se puede observar que IFNγ y el ácido kainic también pueden estimular la expresión de MHCI en neuronas9,30,mientras que la tetrodotoxina disminuye la expresión de MHCI14. Los métodos anteriores para detectar la expresión de MHCI se basaron en la hibridación in situ y el análisis inmunohistoquímico14,15,20,31. Mientras que los análisis mRNA-basados, tales como hibridación in situ y qRT-PCR, pueden determinar la localización espaciotemporal, la especificidad del tipo de célula, y los niveles de transcripción del gen, estos análisis no pueden evaluar la traducción o el transporte de la proteína a la membrana de plasma. El análisis de Immunohistochemical y de la mancha blanca /negra occidental puede determinar diferencias en la expresión de la proteína y la localización potencialmente celular pero puede ser difícil de cuantificar exactamente. Además, muchos anticuerpos MHCI reconocen la estructura terciaria del complejo, y son altamente sensibles a los cambios conformacionales. Así, las condiciones de permeabilización o desnaturalización dan lugar a la pérdida de inmunorreactividad de MHCI32. El método presentado aquí utiliza immunostaining in situ para MHCI, que permite el reconocimiento de la proteína por el anticuerpo en su conformación nativa, seguido por métodos de la fijación y de la permeabilización.
Con ligeras modificaciones, los métodos descritos aquí se pueden utilizar para cultivar otras poblaciones neuronales o para evaluar la expresión de otras proteínas extracelulares de interés. En este protocolo se observan modificaciones fáciles que se pueden hacer para cultivar neuronas corticales, pero los métodos aquí descritos también pueden ser utilizados para cultivar otras poblaciones neuronales, como las neuronas estriadas33. Además, aunque este protocolo especifique immunostaining de MHCI y de NeuN, otros marcadores celulares se pueden identificar de una manera similar. En general, los marcadores extracelulares pueden ser tratados como MHCI y los marcadores intracelulares pueden ser tratados como NeuN. Sin embargo, cabe señalar que durante el paso de disociación celular, las proyecciones axonales se separan del soma. Debido a que la estrategia de gating definida aquí filtra los desechos celulares y se centra en los núcleos neuronales marcador NeuN, las proteínas que se expresan exclusivamente en proyecciones axonales pueden no ser detectadas.
Hasta hace poco, se pensaba que las neuronas expresaban MHCI sólo en respuesta al daño, la infección o la estimulación in vitro de citoquinas para comprometer las células T CD8+ citotóxicas9. Una nueva investigación ha dilucidado otra función del MHCI en la regulación de las conexiones sinápticas durante el desarrollo13. El protocolo descrito aquí utiliza IFNβ para estimular la expresión de MHCI en neuronas cultivadas de tipo salvaje, pero se pueden utilizar métodos similares con una variedad de estímulos celulares o modificaciones genéticas para probar hipótesis específicas. Este método permitirá a los investigadores investigar los mecanismos moleculares que regulan la expresión de MHCI, lo que mejorará la comprensión del papel dicotómico de MHCI en estas dos funciones celulares distintas.

El sistema nervioso central (CNS) fue pensado una vez para ser desprovisto de la vigilancia inmune, referida como "privilegiado inmune1." Ahora está claro que este privilegio no equivale a la ausencia absoluta de componentes inmunes, sino más bien, a una regulación especializada que funciona para limitar el daño asociado a la inmunopatología1. De hecho, la comunicación entre el SNC y el sistema inmunológico es una conversación continua que es necesaria para el desarrollo saludable del cerebro y la respuesta a las infecciones2,3.
Las moléculas principales del complejo de histocompatibilidad clase I (MHCI) son proteínas transmembrana poligénicas y polimórficas más conocidas por su función en la presentación de péptidos antigénicos a las células T CD8+ durante la infección4. Los complejos clásicos de MHCI consisten en una transmembrana α cadena y una cadena ligera extracelular, llamada β2-microglobulina. La cadena α contiene un surco polimórfico que se une a un péptido antigénico para la presentación5. La expresión adecuada de MHCI en la membrana extracelular requiere la acción coordinada de chaperonas moleculares en el retículo endoplásmico para asegurar el plegamiento adecuado de la cadena α y β2-microglobulina junto con la carga de un ligando peptídico de alta afinidad5. Sólo una vez que se ensamblan los complejos MHCI, se exportan del retículo endoplásmico a la membrana plasmática6. Tras el compromiso del receptor cognado de células T con el complejo MHCI cargado de péptidos, las células T CD8+ median la muerte celular liberando gránulos líticos que contienen perforina y granzimas o induciendo apoptosis a través del receptor Fas de unión en la membrana celular diana7. Además, las células TCD8+ producen citoquinas, como el interferón gamma (IFNγ) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), que pueden activar mecanismos antivirales en células infectadas sin efectos citopáticos8,9. Para muchos virus neurotrópicos, cd8+ células T son necesarios para eliminar la infección del SNC10,11,12.
Anteriormente se pensaba que las neuronas expresan MHCI sólo en condiciones de daño, infección viral, o con estimulación in vitro de citoquinas. Recientemente, la investigación ha identificado un papel para la expresión neuronal de MHCI en la remodelación sináptica y la plasticidad13,14. Aunque los mecanismos precisos que subyacen a la regulación de la sinapsis no se entienden bien, los datos indican que el nivel de expresión de MHCI está regulado por la actividad sináptica15,16. Una hipótesis postula que las neuronas expresan inmunoglobulina emparejada como el receptor B (PirB) presinápticamente, que se une a MHCI transynaptically13,17. Esta interacción inicia una cascada de señalización por PirB que se opone a las vías implicadas en la remodelación sináptica, reforzando y estabilizando así la conexión sináptica17,18,19. En ausencia de actividad neuronal, la expresión de MHCI disminuye14,y la pérdida de MHCI resulta en la eliminación defectuosa de la sinapsis y circuitos sinápticos mal organizados20,21.
El ensayo descrito aquí, que fue adaptado de Chevalier et al.9,utiliza el análisis citométrico de flujo para evaluar cuantitativamente la expresión de proteínas extracelulares de MHCI en cultivos primarios de neuronas murinas del hipocampo. Este protocolo ilustra las técnicas iniciales para microdissecting el tejido hippocampal de cachorros embrionarios del ratón. A continuación, detalla los procesos para la disociación enzimática y mecánica del tejido en una suspensión unicelular y los métodos para el mantenimiento de los cultivos invitro. Debido a que no se dividen, una vez que están en cultivo, las neuronas deben ser plateadas en un plato y densidad adecuada para su punto final experimental. A continuación, se describen los pasos para inducir la expresión de MHCI con interferón beta (IFNβ), inmunoetiquetado para MHCI y núcleos neuronales marcador NeuN, y el análisis de células por citometría de flujo. Finalmente, se describen los procedimientos para evaluar los datos de citometría de flujo para identificar las neuronas MHCI-positivas y cuantificar el nivel de la expresión de MHCI. También se observan en este protocolo pequeños ajustes que se pueden hacer con el fin de cultivar neuronas corticales además o en lugar de neuronas del hipocampo. Este protocolo se puede modificar fácilmente para probar hipótesis específicas utilizando variaciones genéticas o tratamientos farmacológicos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm sterile culture dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB012924</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Centrifuge Tubes</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>21-103</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>21-108</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mM EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>FACS Buffer Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP82031Gal</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U-bottom plate</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-221</td>
			<td>Flow Cytometry Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borate Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28341</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Pasteur Pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13 678 20C</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Dissociation Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13 151 014</td>
			<td>Flow Cytometry Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>90083</td>
			<td>Dissociation Solution Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-235</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91113-10</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fix and Perm Cell Permeabilization Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>GAS003</td>
			<td>Flow Cytometry Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate-E Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1247601</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Sealing Sterilization Pouches</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>181254</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon Beta</td>
			<td>PBL Assay Science</td>
			<td>12405-1</td>
			<td>Flow Cytometry Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Mark Anti-NeuN-PE Antibody, clone A60</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>FCMAB317PE</td>
			<td>Flow Cytometry Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse H-2Kb Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116513</td>
			<td>Flow Cytometry Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Solution</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>Dissociation Solution Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Pattern Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91100-12</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo dissection microscope</td>
			<td>Swift</td>
			<td>M29TZ-SM99CL-BTW1</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91401-10</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipets</td>
			<td>Corning</td>
			<td>357575</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101319</td>
			<td>Flow Cytometry Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the expression of major histocompatibility complex class i on primary murine hippocampal neurons by flow cytometry

Las pruebas cada vez mayores apoyan la hipótesis que las interacciones neuro-inmunes afectan la función del sistema nervioso en condiciones homeostáticas y patológicas. Una función bien estudiada de la clase I del complejo de histocompatibilidad mayor (MHCI) es la presentación de péptidos derivados de células al sistema inmune adaptativo, particularmente en respuesta a la infección. Más recientemente se ha demostrado que la expresión de moléculas de MHCI en las neuronas puede modular los cambios dependiente de la actividad en la conectividad sináptica durante el desarrollo normal y trastornos neurológicos. La importancia de estas funciones para la salud del cerebro apoya la necesidad de un ensayo sensible que detecta fácilmente la expresión de MHCI en las neuronas. Aquí se describe un método para el cultivo primario de las neuronas murinas del hipocampo y luego la evaluación de la expresión de MHCI por análisis citométrico de flujo. El hipocampo murino se microdiseca de las crías de ratón prenatales en el día embrionario 18. El tejido se disocia en una suspensión unicelular utilizando técnicas enzimáticas y mecánicas, luego se cultiva en un medio libre de suero que limita el crecimiento de células no neuronales. Después de 7 días in vitro, la expresión de MHCI es estimulada tratando las células cultivadas farmacológicamente con interferón beta. Las moléculas de MHCI se etiquetan in situ con un anticuerpo marcado fluorescentemente, luego las células se disocian no enzimáticamente en una suspensión de una sola célula. Para confirmar la identidad neuronal, las células se fijan con paraformacionaldehído, permeabilizadas y etiquetadas con un anticuerpo marcado fluorescentemente que reconoce el antígeno nuclear neuronal NeuN. La expresión de MHCI entonces es cuantificada en neuronas por análisis cytometric del flujo. Las culturas neuronales se pueden manipular fácilmente por modificaciones genéticas o intervenciones farmacológicas para probar hipótesis específicas. Con ligeras modificaciones, estos métodos se pueden utilizar para cultivar otras poblaciones neuronales o para evaluar la expresión de otras proteínas de interés.

Usando el procedimiento presentado aquí, el tejido hippocampal fue diseccionado de cachorros prenatales del ratón en el día embrionario 18. El tejido fue disociado en una sola suspensión de célula usando métodos enzimáticos y mecánicos, después cultivado en 12 placas bien que fueron pretratadas con poli-D-lisina. Después de 7 días in vitro, las células fueron tratadas con 100 U/mL de IFNβ o medios sólo durante 72 h, lo que estimuló la expresión de MHCI. Las neuronas fueron manchadas in situ para MHCI antes de no-enzimático disociadas en una sola suspensión de la célula. Las neuronas fueron fijadas y permeabilizadas, entonces manchadas intracelular para el marcador neuronal NeuN de los núcleos. Las muestras fueron evaluadas por citometría de flujo y los datos fueron analizados utilizando el software asociado. Las neuronas fueron identificadas a través de la selección secuencial de los eventos totales para excluir los desechos celulares y los dobletes (Figura 1A,B). Las neuronas fueron identificadas definitivamente por neun-positividad (Figura 1C). NeuN+ células se analizaron más a fondo para la MHCI-positividad trazando las células en un histograma con el número de células normalizadas al modo en el eje y y la fluorescencia MHCI en el eje x. Se dibujó una puerta MHCI+ en el punto donde los picos positivos y negativos divergieron (Figura 1D). A partir de esto, el porcentaje de neuronas positivas para la tinción de MHCI (Figura 1E) y la mediana de la intensidad de fluorescencia (IMF; Figura 1F) se calcularon. Los resultados muestran que el tratamiento con IFNβ aumentó significativamente el porcentaje de neuronas positivas para la tinción extracelular de MHCI, así como el nivel de expresión, según lo indicado por MFI. El análisis estadístico y la representación gráfica se realizaron utilizando software estadístico disponible en el mercado.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61436/61436fig1v2.jpg"> Figura 1: Estrategia representativa de gating y cuantificación de MHCI. Las neuronas primarias del hipocampo fueron tratadas con 100 U/mL de IFNβ o medios solamente. Después de 72 h, las neuronas fueron teñidas extracelularmente con MHCI azul-conjugado pacífico (1 μg/mL H2-Kb),entonces intracelular etiquetado con NeuN PE-conjugado (dilución del 1:100). La fluorescencia celular fue evaluada por cytometry de flujo, y los datos eran analizados. (A)Los eventos totales se trazaron como SSC-A (log) vs FSC-A (lineal), y las células (P1) se bloquearon para excluir los desechos. (B)Dentro de la población P1, las células fueron trazadas como FSC-H (lineal) vs FSC-A (lineal) para bloquear la población unicelular. (C)Dentro de la población unicelular, las células fueron trazadas SSC-A (registro) contra NeuN-PE (registro). NeuN+ células fueron cerradas para identificar las neuronas. (D) Dentro de la población de neuronas, las células se trazaron en un histograma con MHCI-PacBlu en el eje x y los números de celda normalizados al modo en el eje y. Se dibujó una puerta horizontal para cuantificar el porcentaje de neuronas positivas para la tinción de MHCI. (E)Cuantificación del porcentaje de MHCI+ de NeuN+ células en medios solamente y neuronas tratadas con IFNβ. (F)Cuantificación de la mediana de la intensidad de fluorescencia (IMF) de MHCI en neun+ células en medios (negro) y ifnβ-tratado (rojo) neuronas. La significación estadística se calculó mediante prueba t no emparejada. **, P < 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61436/61436fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Medios de crecimiento neuronal (50 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reactivo</td>
			<td>Concentración Final</td>
			<td>Concentración de existencias</td>
			<td>Para 50 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Suplemento B27</td>
			<td>2%</td>
			<td>100%</td>
			<td>1,0 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamina</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>200 mM</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penicilina-Estreptomicina</td>
			<td>100 U/ml</td>
			<td>10.000 U/ml</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Medios neurobasales</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>48,0 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Tampón FACS (500 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reactivo</td>
			<td>Concentración Final</td>
			<td>Concentración de existencias</td>
			<td>Para 500 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Suero fetal bovino</td>
			<td>2%</td>
			<td>100%</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>500 mM</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>dPBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>489 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Solución de disociación de papaína</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reactivo</td>
			<td>Concentración Final</td>
			<td>Concentración de existencias</td>
			<td>Para 1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Suspensión de papaína</td>
			<td>20 U/ml</td>
			<td>1000 U/ml</td>
			<td>0,020 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNasa I</td>
			<td>2,5 U/ml</td>
			<td>2500 U/ml</td>
			<td>0,001 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hibernar-E</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1,0 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Nota: El volumen de solución de disociación de papaína necesaria variará dependiendo del número de cerebros embrionarios que se diseccionan. Prepare 0,5 ml por cerebro para las neuronas del hipocampo o 1,0 ml por cerebro para las neuronas corticales.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Nota: Prepare la solución de disociación mediante el vórtice de la suspensión de papaína en Hibernate-E durante aproximadamente 3 min. Después de que la papaína se disuelva completamente, agregue DNase I. No vórtice DNase I.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Medios y soluciones.

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Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Este protocolo describe un método para cultivar neuronas primarias del hipocampo a partir del cerebro embrionario del ratón. La expresión de la clase I importante del complejo de la histocompatibilidad en la superficie extracelular de neuronas cultivadas entonces es evaluada por análisis cytometric del flujo.

Evaluación De La Expresión Del Complejo De Histocompatibilidad Mayor Clase I En Las Neuronas Primarias Murinas Del Hipocampo Por Citometría De Flujo

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

3.3K vistas.  University of North Carolina at Charlotte. Este protocolo describe un método para cultivar neuronas primarias del hipocampo a partir del cerebro embrionario del ratón. La expresión de la clase I importante del complejo de la histocompatibilidad en la superficie extracelular de neuronas cultivadas entonces es evaluada por análisis cytometric del flujo.

Video: Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Análisis por citometría de flujo de células inmunes dentro de aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Investigación

Inmunología e Infección

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

La detección de nanopartículas fluorescentes Interacciones con inmunodeficiencia primaria subpoblaciones celulares por citometría de flujo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

La detección in situ de las células T CD4 Autoreactive en Cerebro y Corazón Uso Mayor de Histocompatibilidad clase II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

Caracterización fenotípica de los macrófagos a partir de riñón de rata por Citometría de Flujo

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Clasificación de células activadas por fluorescencia para la purificación de células dendríticas plasmocitoide de la médula ósea de ratones

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

La evaluación de la función retiniana Microglial fagocítica<em&gt; En Vivo</em&gt; El uso de un ensayo basado en citometría de flujo

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

La neuraminidasa Ensayo de inhibición basado en la fluorescencia para evaluar la susceptibilidad de los virus de la influenza a El Inhibidor de la neuraminidasa clase de antivirales

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

Caracterización de subconjuntos de monocitos humanos de sangre análisis de citometría de flujo

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...