Diese Arbeit wurde von der NIA R00 AG053412 (KEF) unterstützt.

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health und nach den internationalen Leitprinzipien für biomedizinische Forschung mit Tieren durchgeführt. Das Protokoll wurde von der University of North Carolina im Charlotte Institutional Animal Care and Use Committee (Protokoll #19-020) genehmigt.
1. Vorbereitung auf die Kultur
HINWEIS: Diese Verfahren sollten unter sterilen Bedingungen in einem von Gewebekulturen bezeichneten Biosicherheitsschrank durchgeführt werden. Siehe Tabelle 1 für Medien und Lösungen.
<ol><li>Sterilisieren Sie alle Sezierwerkzeuge durch Autoklavieren in selbstdichtenden Sterilisationsbeuteln.</li>
	<li>Bereiten Sie Arbeitsbestände an Poly-D-Lysin für die Behandlung von 12-Well-Kultur-Gerichte.<ol>
<li>Setzen Sie Poly-D-Lysin in 1x Boratpuffer auf und bis zu einer Konzentration von 100 g/ml (10x konzentriert). Ca. 1 ml Aliquots bei -20 °C lagern, bis es benötigt wird.</li>
		<li>10x konzentriertes Poly-D-Lysin in dPBS auf 10 g/ml (1x) verdünnen und filtersterilisieren.</li>
		<li>12-Well-Kulturplatten mit 0,5 ml pro Brunnen von 1x Poly-D-Lysin bei Raumtemperatur mindestens 1 h oder über Nacht für die Verwendung am nächsten Tag behandeln. Stellen Sie sicher, dass das Volumen von Poly-D-Lysin ausreicht, um den unteren Rand des Kulturbereichs vollständig abzudecken.</li>
		<li>Kurz vor der Verwendung Entfernen Sie Poly-D-Lysin von der Kulturplatte, spülen Sie 3x in sterilem Wasser und halten Sie in sterilem Wasser, bis sie bereit sind, Zellen zu verplatten. Entfernen Sie alle Spuren von Flüssigkeit durch eine gründliche Aspiration vor der Beschichtung von Zellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie Neuron Growth Media und FACS-Puffer vor. Filter sterilisieren und bei 4 °C bis zum Gebrauch lagern. Neuron Growth Media kann für ca. 2 wks aufbewahrt werden; DER FACS-Puffer kann für ca. 4 wks aufbewahrt werden.</li>
</ol>2. Sezieren des embryonalen Hippocampus
HINWEIS: Dieses Verfahren kann auf der Tischplatte durchgeführt werden, da es die Verwendung eines Stereomikroskops zur Entfernung von Meningen und Mikrodissektion des Hippocampus erfordert. Halten Sie sich an die strenge aseptische Technik, um potenzielle Verunreinigungen zu minimieren.
<ol><li>Euthanisieren Sie eine zeitschwangere C57BL/6J weibliche Maus am embryonalen Tag 18 in einerCO2-Kammer.</li>
	<li>Die Bauchhaut und das Fell mit 70% EtOH besprühen, dann die Haut mit Gewebezangen kneifen und mit einer chirurgischen Schere einen kleinen Schnitt machen. Das Peritoneum dazu neigen, die Eingeweide und die Gebärmutter freizulegen.</li>
	<li>Greifen Sie die Gebärmutter mit Standard-Musterzange, heben Sie aus der Höhle, und schneiden Sie die Verbindung zum Mesometrium mit feiner Schere. Gebärmutter mit Embryonen auf 100 mm sterile Kunststoffkulturschale auf Eis geben.</li>
	<li>Mit feiner Schere und feinen Zangen, schneiden Sie vorsichtig die Gebärmutter und entfernen Sie die embryonalen Säcke, um Embryonen freizusetzen. Übertragen Sie Embryonen auf eine neue 100 mm sterile Kunststoffkulturschale mit dPBS, die auf Eis gelegt wird.</li>
	<li>Enthaupten Sie embryonale Welpen mit einer feinen Schere und übertragen Sie Köpfe auf eine neue 100 mm sterile Kunststoffkulturschale, die Hibernate-E-Medium enthält, das auf Eis gelegt wird.</li>
	<li>Um das Gehirn zu entfernen, halten Sie den Kopf mit einem Paar feiner Zange in einer Hand. Mit gekrümmten Dumont #7 Zangen in der anderen Hand, legen Sie die Spitze der Zange an der Basis des Schädels und kneifen sie den Knochen und die überlagernde Haut, die sich an der Mittellinie bewegt, ohne das Gehirn zu durchdringen.</li>
	<li>Mit gekrümmten Zangen ziehen Sie die Haut und den Schädel auseinander, um das Gehirn zu belichten. Sweep die gekrümmten Zangen unter dem Gehirn von der exponierten Olfaktor-Lampe zum Kleinhirn, um das Gehirn aus dem Schädel zu heben. Übertragen Sie das Gehirn auf eine neue 100 mm sterile Kunststoffkulturschale mit Hibernate-E-Medium auf Eis gelegt. Wiederholen Sie dies für jedes Gehirn. HINWEIS: Alle Gehirne können in einem einzigen Kulturgericht gesammelt werden, es sei denn, es muss für experimentspezifische Zwecke getrennt werden.</li>
	<li>Unter einem Stereo-Sektionsmikroskop, das mit einem Gehirn nach dem anderen und zwei Paaren steriler Dumont-#5 Zangen arbeitet, olfaktorische Glühbirnen abkniffen und Hirngebungen wegziehen. Eine gründliche Entfernung der Meningen ist notwendig, um eine Kulturelle Kontamination durch andere Zellen zu vermeiden und eine weitere Zerlegung zu ermöglichen.</li>
	<li>Sobald Meningen richtig entfernt sind, öffnet sich die überlegene Seite des Kortex seitlich, wodurch der Hippocampus freilegt wird. Mit Dumont #5 Zangen, kneifen Sie den Hippocampus vom angeschlossenen Kortex weg und übertragen Sie isolierten Hippocampus vorsichtig auf ein steriles 15 ml konisches Rohr, das 5 ml Hibernate-E-Medium auf Eis enthält.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Sezieren für beide Gehirnhälften für jeden embryonalen Mauswelpen und kombinieren Sie alle Hippocampi zu einem einzigen 15 ml konischen Röhrchen, es sei denn, dies wird separat für experimentespezifische Zwecke benötigt.<ol>
<li>Um kortikale Neuronen zu kultur, kann der Kortex vom Subcortex getrennt und identisch mit Hippocampus-Neuronen verarbeitet werden. HINWEIS: An diesem Punkt kann das Protokoll angehalten werden. Speichern Sie Gehirne oder sezierte Hippocampi in Hibernate-E Medium ergänzt mit B27 (2%) bei 4 °C für bis zu 1 Monat, obwohl eine längere Verzögerung die Anzahl der lebensfähigen Zellen gefährden kann.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Dissoziierende und kultivierende Hippocampus-Neuronen
HINWEIS: Alle Verfahren sollten unter sterilen Bedingungen in einem als Biosicherheitsschrank bezeichneten Gewebekultur-Schrank durchgeführt werden.
<ol><li>Bereiten Sie 0,5 ml Papain-Dissoziationslösung pro Embryo für hippocampale Dissoziation vor. Das benötigte Volumen der Dissoziationslösung hängt von der Anzahl der embryonalen Gehirne ab, die seziert werden. HINWEIS: Für die kortikale Neuronenkultur 1,0 ml Papainlösung pro Embryo vorbereiten.<ol>
<li>Lösen Sie 20 l Papainsuspension pro 1 ml des Hibernate E Mediums durch Wirbeln für ca. 3 min auf.</li>
		<li>Nachdem Papain aufgelöst wurde, fügen Sie 1 l DNase I pro 1 ml der Lösung hinzu. Wirbeln Sie die Lösung nicht, nachdem DNase I hinzugefügt wurde, da dies das Enzym deaktivieren kann.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zentrifuge 15 ml konische Röhre mit Hippocampusgewebe (Schritt 2.10) bei 1.000 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie Papain-Lösung hinzu. Setzen Sie das Gewebe wieder aus, indem Sie es mehrmals umkehren. Bei 37 °C für 30 min inkubieren, um das Gewebe alle 10 min wieder aufzuhängen.<ol>
<li>Wenn Sie kortikale Neuronen kultivieren, übertragen Sie alle Kortiken auf eine neue 100 mm sterile Kulturschale, saugen Sie sorgfältig Medien von der Platte und Hackfleischgewebe mit feiner Schere oder Rasierklinge. Papain-Lösung in die Kulturschale geben und kortikales Gewebe mit Papainlösung mit einer sterilen Transferpipette in 15 ml konische Röhre übertragen. Gewebe- und Enzymlösung bei 37 °C für 30 min inkubieren und alle 10 min aufregen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Während 30 min Inkubation, bereiten Sie 3 feuerpolierte Glas Pasteur Pipetten: 1 vollständig offen, 1 hälfte offen und 1 Viertel offen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie nach der 30 min Inkubation die 15 ml konische Röhre mit verdautem Hirngewebe bei 125 x g für 10 min. Entfernen Sie die Enzymlösung und ersetzen Sie sie durch ein gleiches Volumen an frischem Hibernate E Medium.</li>
	<li>Mit vollständig geöffneter Pasteurpipette das Gewebe 10x trituieren. Lassen Sie das Gewebe für 2 min absetzen und übertragen Sie dann die überstande Zellsuspension in ein steriles 50 ml konisches Rohr. Fügen Sie ein gleiches Volumen von Hibernate E Medium zurück zum Gewebe.</li>
	<li>Mit halb offener Pasteur Pipette, triturat Gewebe 10x. Lassen Sie das Gewebe für 2 min absetzen und übertragen Sie dann die überstande Zellsuspension auf das gleiche 50 ml konische Rohr wie im vorherigen Schritt. Fügen Sie ein gleiches Volumen von Hibernate E Medium zurück zum Gewebe.</li>
	<li>Mit Viertel offen Pasteur Pipette, triturate Gewebe 10x. Lassen Sie das Gewebe für 2 min absetzen, dann übertragen Sie die überstande Zellsuspension wieder auf die gleiche 50 ml konisch wie in den vorherigen Schritten. Entsorgen Sie das verbleibende Gewebe, das sich nicht dissoziiert hat.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das 50 ml konische Rohr, das den Überstand aus der Zellsuspension bei 125 x g für 5 min enthält. Wenn nicht bereits getan, waschen Sie poly-D-Lysin-beschichtete Platten mit sterilem Wasser und entfernen Sie alle Spuren von Flüssigkeit durch gründliche Aspiration während der Zentrifugation.</li>
	<li>Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen und das Zellpellet in 5 ml Neuron Growth Media wieder aussetzen. Zählen Sie lebende Zellen mit Trypanblau und Hämozytometer.<ol>
<li>Wenn sie kortikale Neuronen kultivieren, fügen Sie mindestens 10 ml Neuron Growth Media für weniger dichte Zellen und genauere Zählung hinzu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verdünnung von Zellen mit Neuron Growth Media für eine endgültige Beschichtungsdichte von 5 x 105 lebensfähigen Zellen pro ml und fügen Sie 1 ml verdünnte Zellsuspension zu jedem Brunnen einer 12-Well-Platte hinzu. Neuronen bei 37 °C mit 5%CO2erhalten. HINWEIS: Typischerweise ergeben die Hippocampi von 1 embryonalen Maushirn, d.h. 2 Hippocampi, etwa 1 x 106 lebensfähige Zellen. Diese Nummer wird nur für Experimentplanungszwecke bereitgestellt und sollte nicht als Ersatz für das Zählen von Zellen für jede Kultur betrachtet werden.</li>
	<li>Ändern Sie die Wachstumsmedien am Tag nach der Kultur, indem Sie die Hälfte des Medienvolumens aus jedem Brunnen entfernen, d. h. 0,5 ml, und fügen Sie eine gleiche Menge an frischen Medien zur Seite des Brunnens hinzu, um zu vermeiden, dass die kultivierten Zellen gestört werden. Komplette Halbmedienwechsel zweimal wöchentlich für die Lebensdauer der Kultur.</li>
</ol>4. Beurteilung der MHCI-Expression durch Durchflusszytometrie
<ol><li>Bereiten Sie die Behandlung durch Verdünnung von Interferon beta (IFN) oder einem gleichen Volumen von Verdünnungsmittel in Neuron Growth Media vor. Da der Medienwechsel ein halbbänderischer Wechsel sein wird, bereiten Sie Behandlungsmedien mit 2x konzentriertem IFN- d.h. zur Behandlung von 3 Brunnen einer 12-Well-Platte mit 100 U/ml IFN, 1,5 ml mit 200 U/ml IFN oder gleicher Menge ifN-Verdünnungsmittel für medienbehandelte Kontrollen vorbereiten.</li>
	<li>Entfernen Sie 0,5 ml aus jedem Brunnen der Neuronen und fügen Sie 0,5 ml Neuron Growth Media mit oder ohne IFN zu jedem Brunnen hinzu. Inkubieren unter normalen Wachstumsbedingungen (37 °C, 5% CO2) für 6-72 h, abhängig von experimentellen Bedingungen und Signaloptimierung.</li>
	<li>Nach der Behandlungszeit, entfernen Sie alle Kulturmedien und waschen Sie vorsichtig einmal in kalten neurobasalen Medien ohne Ergänzungen (B27, L-Glutamin, Pen-Strep).</li>
	<li>Fügen Sie 0,5 ml nicht-supplementiertes kaltes neurobasales Medium hinzu, das 1 g/ml Fc-Block und 1 g/ml fluoreszierenden konjugierten Anti-MHCI-Antikörper enthält. Bei 4 °C 45 min vor Licht schützen.</li>
	<li>Entlegen Sie die antikörperhaltigen Medien und waschen Sie sie vorsichtig einmal in kaltem dPBS. Fügen Sie jedem Brunnen 0,5 ml enzymfreie Zelldissoziationspuffer mit Raumtemperatur hinzu und agitieren Sie, um Zellen zu vertreiben. Achten Sie auf die Dissoziation mit dem invertierten Gewebekulturmikroskop.</li>
	<li>Sobald zellen von der Kulturschale gelöst sind, fügen Sie 0,5 ml FACS-Puffer zu jedem Brunnen hinzu, trituieren Zellen, um Klumpen zu dispergieren, und übertragen Sie das Gesamtvolumen jedes Brunnens auf einzelne 1,7 ml Mikrozentrifugenrohre.</li>
	<li>Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand, setzen Sie das Zellpellet in 100 l FACS-Puffer wieder auf und übertragen Sie das Gesamtvolumen jedes Rohres auf einzelne Brunnen einer 96-Well-U-Bodenplatte.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Brunnen 100 l fixatives Reagenz hinzu. Trituieren Sie mehrmals, um zu vermeiden, dass Zellen verklumpen und 15 min bei Raumtemperatur vor Licht geschützt inkubieren.</li>
	<li>Zentrifuge bei 500 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie ihn in 200 l FACS-Puffer wieder auf.</li>
	<li>Zentrifuge bei 500 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das permeabilisierungsreagenz in 100 l an jedem Brunnen in 100 l an. Gut mischen, dann bei Raumtemperatur vor Licht geschützt mit Schaukeln für 20 min inkubieren.</li>
	<li>Nach der Inkubation zentrifugieren Sie bei 500 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie ihn in 100 L FACS-Puffer wieder auf. 2x wiederholen.</li>
	<li>Nach der Endwäsche die Zellen in 100 l mit 2% Paraformaldehyd, verdünnt im FACS-Puffer, wieder aussetzen. Mischen Sie gut, um zu verhindern, dass Zellen verklumpen. Bei 4 °C vor Licht geschützt bis zur Ablesung auf einem Durchflusszytometer lagern. Lesen Sie die Proben so schnell wie möglich, innerhalb von 1 Woche.</li>
</ol>5. Quantifizierung und Auswertung von Daten
<ol><li>Messen Sie die Kompensationskontrollen für jeden Fluoreszenzfarbstoff und korrigieren Sie alle Spektralüberlappungen. Ideale Kompensationskontrollen umfassen kultivierte Neuronen, die nicht gefärbt, nur mit Anti-MHCI gefärbt und nur mit Anti-NeuN gefärbt sind.</li>
	<li>Zeichnen Sie nach Möglichkeit 100.000 Ereignisse für jedes Beispiel auf (mindestens 10.000) und speichern Sie sie als FCS-Dateien.</li>
	<li>Um Daten mithilfe geeigneter Analysesoftware zu analysieren, richten Sie sequenzielle Gates ein, wie in Abbildung 1A-C dargestellt, um sie für NeuN-positive Neuronen auszuwählen.<ol>
<li>Plot SSC-A (log) vs FSC-A (linear). Zeichnen Sie ein Tor auf die Zellpopulation (P1), um zelluläre Ablagerungen aus der Analyse zu entfernen.</li>
		<li>Innerhalb der Zellpopulation P1, Diagramm FSC-H (linear) vs FSC-A (linear). Zeichnen Sie ein Tor auf der Einzelzellenpopulation.</li>
		<li>Innerhalb der Einzelzellpopulation, Plot SSC-A (log) vs NeuN (log). Zeichnen Sie ein Tor auf NeuN-positive Population mit ungefärbten oder MHCI-nur gefärbten Zellen als Leitfaden.</li>
		<li>Zeichnen Sie ein Histogramm der MHCI-Fluoreszenz mit zellulären Ereignissen, die auf der y-Achse normalisiert wurden. Zeichnen Sie ein horizontales Tor, um die prozentualen Neuronen positiv für MHCI zu quantifizieren.</li>
		<li>Exportieren Sie die Prozentzellen positiv für MHCI sowie die mediane Fluoreszenzintensität (MFI) für MHCI auf die NeuN-positive Population zur statistischen Auswertung und grafischen Zeichnung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Flow+Cytometric+Analysis+of+Central+Nervous+System+Tissue+Reveals+Novel+Functional+Relationships+Among+Cells+Expressing+CD133,+CD15,+and+CD24.">Optimized Flow Cytometric Analysis of Central Nervous System Tissue Reveals Novel Functional Relationships Among Cells Expressing CD133, CD15, and CD24.</a> Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).</li><li>Snaidero, N., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+at+a+glance.">Myelination at a glance.</a> Journal of Cell Science. 127 (14), 2999-3004 (2014).</li><li>Martin, D., Xu, J., Porretta, C., Nichols, C. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHCI+negatively+regulates+synapse+density+during+the+establishment+of+cortical+connections.">MHCI negatively regulates synapse density during the establishment of cortical connections.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 442-451 (2011).</li><li>Facci, L., Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Rodent+Cortical,+Hippocampal,+and+Striatal+Neurons.">Culture of Rodent Cortical, Hippocampal, and Striatal Neurons.</a> Methods Molecular Biology. 1727, 39-47 (2018).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Protokoll beschreibt die Zerlegung und Kultur der primären Hippocampus-Neuronen von pränatalen Mauswelpen am embryonalen Tag 18. Die Verwendung von primären Neuronen, die von Nagetieren kultiviert werden, ist eine der grundlegendsten Methoden, die in der modernen Neurobiologie entwickelt wurden22. Obwohl verewigte Zelllinien bestimmte Aspekte von Neuronen modellieren können, lässt ihre Natur als tumorabgeleitete Zellen, das Versagen, definierte Axone zu entwickeln, und die fortgesetzte Zellteilung Zweifel aufkommen, ob sie die Eigenschaften post-mitotischer Neuronen in vivo23originalgetreu rekapitulieren. Eine weitere Alternative zu primären Neuronen ist die Verwendung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs). Die Technologie für den Einsatz von HiPSCs, insbesondere solche, die von Patienten abgeleitet sind, hat sich in den letzten Jahren rasant weiterentwickelt24. Allerdings gibt es immer noch Einschränkungen bei der Arbeit mit HiPSCs, einschließlich Variabilität zwischen Zelllinien, mangelnde funktionelle Reife und Unterschiede in epigenetischen Profilen25. Obwohl es auch Einschränkungen bei der Arbeit mit dem reduktionistischen Modell der primären Nagetier-Neuronen gibt, behalten kultivierte Neuronen die post-mitotische Natur von Neuronen in vivo. Außerdem bevorzugen die umfangreichen molekularbiologischen Werkzeuge und genetischen Modifikationen, die für Mäuse verfügbar sind, die Verwendung von primären Neuronen gegenüber HiPSCs für viele Anwendungen, und Mausstudien können leicht in den komplexeren In-vivo-Organismus übersetzt werden, ohne das experimentelle genetische System zu verlieren. Aus diesen Gründen, viele Forscher verwenden primäre Nagetier Neuronen, um Schlüsselaspekte zu überprüfen, wenn nicht die Masse, ihrer Forschung.
Für bestimmte Assays können Neuronen direkt nach der Isolierung aus dem Gehirn ex vivo analysiertwerden. Dies ist besonders wünschenswert für Experimente mit erwachsenen Mäusen, die bestimmten Versuchsbedingungen ausgesetzt sein können oder die von Wechselwirkungen mehrerer Zelltypen abhängen können; Es gibt jedoch mehrere Probleme, die die Art der Analysen einschränken, die durchgeführt werden können. Es ist technisch schwierig, eine einzelzellige Suspension von Neuronen aus dem Gehirn von erwachsenen Mäusen vorzubereiten, weil Neuronen einzigartig miteinander verbunden sind und durch Myelin26verzahnt sind. Nicht-enzymatische Methoden der Gewebetrituration sind ineffizient bei der Dissoziierung des Gewebes und verursachen zelltodig, während enzymatische Präparate oft Zelloberflächenantigenespalten 27. Darüber hinaus, während Myelin ist weitgehend fehlt bei embryonalen Mäusen, Es umfasst etwa 20% des erwachsenen Gehirns, und kann lebensfähige Zellisolation beeinträchtigen und behindern Flusszytometrie-Analyse28. Viele der Techniken, die entwickelt wurden, entfernen schließlich Neuronen ihres Zytosols und hinterlassen kleine, abgerundete Zellkörper, die hauptsächlich aus Kernenbestehen 29. Obwohl dies für einige Analysen akzeptabel ist, ist dies nicht geeignet, um die zytoplasmatische oder extrazelluläre Proteinexpression zu quantifizieren. Darüber hinaus ermöglicht das reduktionistische Zellkultursystem das Testen spezifischer mechanistischer Fragen auf einer kürzeren Zeitskala, als dies häufig mit einem In-vivo-System möglich ist.
Ebenfalls in diesem Protokoll beschrieben sind Methoden zur pharmakologischen Stimulierung der MHCI-Expression mit IFN- und die Quantifizierung der extrazellulären MHCI-Expression durch Durchflusszytometrie. Die Stimulation durch IFN ist eine nützliche positive Kontrolle zum Testen anderer experimenteller Bedingungen, aber es kann angemerkt werden, dass IFN und Kainsäure auch die MHCI-Expression in den Neuronen9,30stimulieren können, während Tetrodotoxin die MHCI-Expression14verringert. Frühere Methoden zum Nachweis der MHCI-Expression stützten sich auf In-situ-Hybridisierung und immunhistochemische Analyse14,15,20,31. Während mRNA-basierte Assays, wie In-situ-Hybridisierung und qRT-PCR, die raumzeitliche Lokalisation, die Zelltypspezifität und den Grad der Gentranskription bestimmen können, können diese Assays die Proteintranslation oder den Transport zur Plasmamembran nicht bewerten. Immunhistochemische und westliche Blot-Analysen können Unterschiede in der Proteinexpression und potenziell zellulären Lokalisation bestimmen, können aber schwierig zu quantifizieren sein. Darüber hinaus erkennen viele MHCI-Antikörper die tertiäre Struktur des Komplexes und sind hochempfindlich gegenüber konformen Veränderungen. Dadurch führen Permeabilisierungs- oder Denaturierungsbedingungen zum Verlust der MHCI-Immunreaktivität32. Die hier vorgestellte Methode verwendet In-situ-Immunostainierung für MHCI, die die Erkennung des Proteins durch den Antikörper in seiner nativen Konformation ermöglicht, gefolgt von Fixierungs- und Permeabilisierungsmethoden.
Mit leichten Modifikationen können die hier beschriebenen Methoden verwendet werden, um andere neuronale Populationen zu kultitogen oder die Expression anderer extrazellulärer Proteine von Interesse zu bewerten. In diesem Protokoll sind einfache Modifikationen, die vorgenommen werden können, um kortikale Neuronen zu kulturieren, aber die hier beschriebenen Methoden können auch verwendet werden, um andere neuronale Populationen zu kulturieren, wie striatale Neuronen33. Obwohl dieses Protokoll die Immunfärbung von MHCI und NeuN festlegt, können andere zelluläre Marker in ähnlicher Weise identifiziert werden. Im Allgemeinen können extrazelluläre Marker wie MHCI und intrazelluläre Marker wie NeuN behandelt werden. Es sollte jedoch beachtet werden, dass während des zellulären Dissoziationsschritts axonale Projektionen vom Soma abgetrennt werden. Da die hier definierte Gating-Strategie zelluläre Trümmer abschirmt und sich auf den neuronalen Kernmarker NeuN konzentriert, können Proteine, die ausschließlich in axonalen Projektionen exprimiert werden, nicht nachgewiesen werden.
Bis vor kurzem, Neuronen wurden gedacht, um MHCI nur als Reaktion auf Schäden auszudrücken, Infektion, oder In-vitro-Zytokin-Stimulation, um zytotoxische CD8+ T-Zellen9zu engagieren. Neue Forschung hat eine weitere Funktion von MHCI bei der Regulierung synaptischer Verbindungen während der Entwicklung13aufgeklärt. Das hier beschriebene Protokoll verwendet IFN, um die MHCI-Expression in Wildtyp-kultivierten Neuronen zu stimulieren, aber ähnliche Methoden können mit einer Vielzahl von zellulären Reizen oder genetischen Modifikationen verwendet werden, um spezifische Hypothesen zu testen. Diese Methode wird es den Forschern ermöglichen, die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die MHCI-Expression regulieren, was das Verständnis der dichotomen Rolle von MHCI auf diesen beiden unterschiedlichen zellulären Funktionen verbessern wird.

Das zentrale Nervensystem (ZNS) galt einst als frei von Immunüberwachung, genannt als "immunprivilegiert1". Es ist jetzt klar, dass dieses Privileg nicht gleichbedeutend mit dem absoluten Fehlen von Immunkomponenten ist, sondern mit einer speziellen Regelung, die funktioniert, um den Schaden im Zusammenhang mit der Immunpathologie zu begrenzen1. In der Tat, Kommunikation zwischen dem ZNS und dem Immunsystem ist ein laufendes Gespräch, das für eine gesunde Gehirnentwicklung und Reaktion auf Infektionen notwendig ist2,3.
Wichtige Histokompatibilitätskomplex-Moleküle der Klasse I (MHCI) sind polygene und polymorphe Transmembranproteine, die am besten für ihre Funktion bei der Darstellung antigener Peptide gegenüber CD8+ T-Zellen während der Infektion4bekannt sind. Klassische MHCI-Komplexe bestehen aus einer Transmembran-α-Kette und einer extrazellulären Lichterkette, der sogenannten 2-Mikroglobulin. Die α-Kette enthält eine polymorphe Nut, die ein antigenes Peptid für Diepräsentation5bindet. Die richtige Expression von MHCI auf der extrazellulären Membran erfordert eine koordinierte Wirkung molekularer Chaperonen am endoplasmatischen Retikulum, um eine ordnungsgemäße Faltung des α-Kette und des 2-Mikroglobulins zusammen mit der Belastung eines Hochaffinitätspeptidligands zu gewährleisten5. Erst wenn MHCI-Komplexe zusammengesetzt sind, werden sie aus dem endoplasmatischen Retikulum in die Plasmamembran6exportiert. Nach Der Einbindung des kogatierten T-Zellrezeptors mit dem Peptid-belasteten MHCI-Komplex vermitteln CD8+ T-Zellen die Zelltötung durch Freisetzung von lytischem Granulat, das Perforin und Granzyme enthält, oder durch Induktion von Apoptose durch Bindung des Fas-Rezeptors auf die Zielzellmembran7. Zusätzlich produzieren CD8+ T-Zellen Zytokine, wie Gamma-Interferon (IFN) und Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF), die antivirale Mechanismen in infizierten Zellen ohne zytopathische Wirkungen aktivieren können8,9. Für viele neurotrope Viren sind CD8+ T-Zellen notwendig, um die Infektion von der ZNS10,11,12zu befreien.
Es wurde früher angenommen, dass Neuronen MHCI nur unter Bedingungen von Schäden, Virusinfektionen oder mit In-vitro-Zytokinstimulation ausdrücken. Kürzlich hat die Forschung eine Rolle für die neuronale Expression von MHCI bei synaptischen Remodeling und Plastizitätidentifiziert 13,14. Obwohl die genauen Mechanismen, die der Synapsenregulation zugrunde liegen, nicht gut verstanden werden, deuten die Daten darauf hin, dass der MHCI-Expressionsgrad durch die synaptische Aktivität15,16reguliert wird. Eine Hypothese geht davon aus, dass Neuronen gepaarte Immunglobulin-ähnliche RezeptorEn B (PirB) präsynaptisch ausdrücken, die MHCI transynaptisch13,17bindet. Diese Wechselwirkung initiiert eine Signalkaskade von PirB, die sich gegen Wege wendet, die an der synaptischen Umgestaltung beteiligt sind, wodurch die synaptische Verbindung17,18,19verstärkt und stabilisiert wird. In Ermangelung einer neuronalen Aktivität wird die MHCI-Expression um14verringert, und der Verlust von MHCI führt zu einer fehlerhaften Synapsenelimination und falsch organisierten synaptischen Schaltkreisen20,21.
Der hier beschriebene Assay, der von Chevalier et al.9adaptiert wurde, verwendet eine zytometrische Flussanalyse, um die extrazelluläre Proteinexpression von MHCI auf Primärkulturen muriner Hippocampus-Neuronen quantitativ zu bewerten. Dieses Protokoll veranschaulicht die ersten Techniken zur Mikrosezieren von Hippocampusgewebe aus embryonalen Mauswelpen. Es beschreibt dann Prozesse für die enzymatische und mechanische Dissoziation von Gewebe in eine einzelzellige Suspension und Methoden zur Aufrechterhaltung der Kulturen in vitro. Weil sie sich nicht teilen, müssen Neuronen, sobald sie in der Kultur sind, in einer Schale und einer Dichte plattiert werden, die für ihren experimentellen Endpunkt geeignet ist. Als nächstes werden Schritte zur Induktion der MHCI-Expression mit Beta-Interferon (IFN), zur Immunkennzeichnung für MHCI und neuronalen Kernmarker NeuN und zur Analyse von Zellen durch Durchflusszytometrie beschrieben. Schließlich werden Verfahren zur Bewertung der Durchflusszytometriedaten zur Identifizierung von MHCI-positiven Neuronen und zur Quantifizierung des Niveaus der MHCI-Expression beschrieben. In diesem Protokoll sind auch kleine Anpassungen aufgeführt, die vorgenommen werden können, um kortikale Neuronen zusätzlich zu oder anstelle von Hippocampus-Neuronen zu kulturieren. Dieses Protokoll kann leicht geändert werden, um spezifische Hypothesen mit genetischen Variationen oder pharmakologischen Behandlungen zu testen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm sterile culture dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB012924</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Centrifuge Tubes</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>21-103</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>21-108</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mM EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>FACS Buffer Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP82031Gal</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U-bottom plate</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-221</td>
			<td>Flow Cytometry Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borate Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28341</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Pasteur Pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13 678 20C</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Dissociation Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13 151 014</td>
			<td>Flow Cytometry Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>90083</td>
			<td>Dissociation Solution Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-235</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91113-10</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fix and Perm Cell Permeabilization Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>GAS003</td>
			<td>Flow Cytometry Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate-E Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1247601</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Sealing Sterilization Pouches</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>181254</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon Beta</td>
			<td>PBL Assay Science</td>
			<td>12405-1</td>
			<td>Flow Cytometry Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Mark Anti-NeuN-PE Antibody, clone A60</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>FCMAB317PE</td>
			<td>Flow Cytometry Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse H-2Kb Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116513</td>
			<td>Flow Cytometry Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Solution</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>Dissociation Solution Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Pattern Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91100-12</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo dissection microscope</td>
			<td>Swift</td>
			<td>M29TZ-SM99CL-BTW1</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91401-10</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipets</td>
			<td>Corning</td>
			<td>357575</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101319</td>
			<td>Flow Cytometry Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the expression of major histocompatibility complex class i on primary murine hippocampal neurons by flow cytometry

Zunehmende Beweise stützen die Hypothese, dass neuroimmune Wechselwirkungen die Funktion des Nervensystems sowohl bei homöostatischen als auch bei pathologischen Bedingungen beeinflussen. Eine gut untersuchte Funktion der großen Histokompatibilitätskomplexklasse I (MHCI) ist die Darstellung von zellabgeleiteten Peptiden für das adaptive Immunsystem, insbesondere als Reaktion auf Infektionen. In jüngerer Zeit hat sich gezeigt, dass die Expression von MHCI-Molekülen auf Neuronen aktivitätsabhängige Veränderungen der synaptischen Konnektivität während der normalen Entwicklung und neurologischen Störungen modulieren kann. Die Bedeutung dieser Funktionen für die Gesundheit des Gehirns unterstützt die Notwendigkeit eines empfindlichen Assays, der die MHCI-Expression auf Neuronen leicht erkennt. Hier beschreiben wir eine Methode zur primärer Kultur der murinen Hippocampus-Neuronen und anschließend die Bewertung der MHCI-Expression durch zytometrische Flussanalyse. Der murinische Hippocampus wird am embryonalen Tag 18 von pränatalen Mauswelpen mikroseziert. Gewebe wird mit enzymatischen und mechanischen Techniken in eine einzelzellige Suspension zerlegt und dann in einem serumfreien Medium kultiviert, das das Wachstum nicht-neuronaler Zellen begrenzt. Nach 7 Tagen in vitro wird die MHCI-Expression durch pharmakologisch eiternde Behandlung kultivierter Zellen mit Beta-Interferon stimuliert. MHCI-Moleküle werden in situ mit einem fluoreszierend markierten Antikörper gekennzeichnet, dann werden Zellen nicht enzymatisch in eine einzellige Suspension dissoziiert. Um die neuronale Identität zu bestätigen, werden die Zellen mit Paraformaldehyd fixiert, permeabilisiert und mit einem fluoreszierend markierten Antikörper gekennzeichnet, der das neuronale Kernantigen NeuN erkennt. Die MHCI-Expression wird dann durch zytometrische Flussanalyse auf Neuronen quantifiziert. Neuronale Kulturen können leicht durch genetische Modifikationen oder pharmakologische Interventionen manipuliert werden, um spezifische Hypothesen zu testen. Mit leichten Modifikationen können diese Methoden verwendet werden, um andere neuronale Populationen zu kultitogen oder die Expression anderer Proteine von Interesse zu bewerten.

Mit dem hier vorgestellten Verfahren wurde Hippocampusgewebe am embryonalen Tag 18 von pränatalen Mauswelpen seziert. Das Gewebe wurde mit enzymatischen und mechanischen Methoden in eine einzellige Suspension zerlegt und dann in 12 Brunnenplatten kultiviert, die mit Poly-D-Lysin vorbehandelt wurden. Nach 7 Tagen in vitro wurden die Zellen mit 100 U/ml IFN oder Medien nur für 72 h behandelt, was die Expression von MHCI stimulierte. Neuronen wurden in situ für MHCI gefärbt, bevor sie nicht-enzymatisch in eine einzellige Suspension dissoziiert wurden. Neuronen wurden fixiert und permeabilisiert, dann intrazellulär für neuronale Kerne Marker NeuN gefärbt. Die Proben wurden mittels Durchflusszytometrie bewertet und die Daten wurden mit zugehöriger Software analysiert. Neuronen wurden durch sequenzielle Gating der Gesamtereignisse identifiziert, um zelluläre Ablagerungen und Doublets auszuschließen (Abbildung 1A,B). Neuronen wurden definitiv durch NeuN-Positivität identifiziert (Abbildung 1C). NeuN+ Zellen wurden weiter auf MHCI-Positivität analysiert, indem Zellen auf einem Histogramm mit der Anzahl der Zellen, die in den Modus auf der y-Achse normalisiert wurden, und MHCI-Fluoreszenz auf der x-Achse dargestellt wurden. Ein MHCI+ Gate wurde an dem Punkt gezeichnet, an dem positive und negative Spitzen auseinandergingen (Abbildung 1D). Daraus werden die prozentualen Neuronen positiv für die MHCI-Färbung (Abbildung 1E) und die mediane Fluoreszenzintensität (MFI; Abbildung 1F) berechnet wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass die IFN-Behandlung den Anteil der Neuronen positiv für die extrazelluläre Färbung von MHCI sowie den Grad der Expression, wie durch MFI angegeben, signifikant erhöht hat. Statistische Auswertungen und grafische Darstellungen wurden mit kommerziell verfügbarer statistischer Software durchgeführt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61436/61436fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Repräsentative Gating-Strategie und MHCI-Quantifizierung. Primäre Hippocampus-Neuronen wurden nur mit 100 U/ml IFN oder Medien behandelt. Nach 72 h wurden Neuronen extrazellulär mit pacific Blue-conjuged MHCI (1 g/mL H2-Kb)gefärbt, dann intrazellulär mit PE-konjugiertem NeuN (1:100 Verdünnung) gekennzeichnet. Die zelluläre Fluoreszenz wurde durch Durchflusszytometrie und Daten analysiert. (A) Gesamtereignisse wurden als SSC-A (log) vs FSC-A (linear) und Zellen (P1) geziert, um Trümmer auszuschließen. (B) Innerhalb der P1-Population wurden Zellen als FSC-H (linear) vs FSC-A (linear) dargestellt, um die Einzelzellpopulation zu bevölkern. (C) Innerhalb der Einzelzellpopulation wurden Zellen SSC-A (log) vs NeuN-PE (log) geplottet. NeuN+ Zellen wurden abgezäut, um Neuronen zu identifizieren. (D) Innerhalb der Neuronenpopulation wurden Zellen auf einem Histogramm mit MHCI-PacBlu auf der x-Achse und Zellzahlen dargestellt, die auf der y-Achse normalisiert wurden. Ein horizontales Tor wurde gezogen, um den Prozentsatz der Neuronen positiv für MHCI Färbung zu quantifizieren. (E) Quantifizierung von Prozent MHCI+ von NeuN+ Zellen nur in Medien und IFN-behandelten Neuronen. (F) Quantifizierung der medianen Fluoreszenzintensität (MFI) von MHCI auf NeuN+ Zellen in Medien (schwarz) und IFN-behandelten (roten) Neuronen. Die statistische Signifikanz wurde durch einen ungepaarten t-Test berechnet. **, P < 0.01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61436/61436fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Neuron Growth Media (50 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagenz</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Für 50 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>B27 Ergänzung</td>
			<td>2%</td>
			<td>100%</td>
			<td>1,0 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-Glutamin</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>200 mM</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>100 U/ml</td>
			<td>10.000 U/ml</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Neurobasale Medien</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>48,0 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">FACS Puffer (500 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagenz</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Für 500 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fetales Rinderserum</td>
			<td>2%</td>
			<td>100%</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Edta</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>500 mM</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>dPBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>489 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Papain Dissoziationslösung</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagenz</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Für 1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Papain Suspension</td>
			<td>20 U/ml</td>
			<td>1000 U/ml</td>
			<td>0,020 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNase I</td>
			<td>2,5 U/ml</td>
			<td>2500 U/ml</td>
			<td>0,001 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Überwinterung-E</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1,0 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Hinweis: Das benötigte Volumen der Papain Dissociation Solution hängt von der Anzahl der embryonalen Gehirne ab, die seziert werden. Bereiten Sie 0,5 ml pro Gehirn für Hippocampus-Neuronen oder 1,0 ml pro Gehirn für kortikale Neuronen vor.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Hinweis: Bereiten Sie die Dissoziationslösung vor, indem Sie die Papainsuspension im Hibernate-E ca. 3 min auswirbeln. Nachdem Papain gründlich aufgelöst ist, fügen Sie DNase I hinzu. Wirbel DNase I nicht.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Medien und Lösungen.

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Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kultivierung primärer Hippocampus-Neuronen aus dem embryonalen Maushirn. Der Ausdruck der großen Histokompatibilitätskomplexklasse I auf der extrazellulären Oberfläche kultivierter Neuronen wird dann durch zytometrische Flussanalyse bewertet.

Bewertung des Ausdrucks der Haupthistokompatibilität scomplex Klasse I auf primären murine nurinischen Hippocampus-Neuronen durch Flow Cytometry

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

3.3K Aufrufe.  University of North Carolina at Charlotte. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kultivierung primärer Hippocampus-Neuronen aus dem embryonalen Maushirn. Der Ausdruck der großen Histokompatibilitätskomplexklasse I auf der extrazellulären Oberfläche kultivierter Neuronen wird dann durch zytometrische Flussanalyse bewertet.

Serie: Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellen innerhalb Murine Aorten

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Mensch In Vitro Suppression als Screening-Tool für die Anerkennung von Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Detektion von fluoreszierenden Nanopartikel Wechselwirkungen mit primären Immun-Zell-Subpopulationen durch Durchflusszytometrie

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

In-situ-Nachweis autoreaktiver CD4-T-Zellen in Gehirn und Herz Mit Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

Die Beurteilung Retinal Microglial Phagozytische Funktion<em&gt; In Vivo</em&gt; Mit einem Durchfluss-Zytometrie basierten Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Fluoreszenz-basierte Neuraminidase-Inhibitionsassay die Empfänglichkeit der Influenza-Viren an die Neuraminidase-Inhibitor-Klasse von Anti-Virus zu beurteilen

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

Charakterisierung der menschliche Monocyte Teilmengen von Vollblut Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and tumor development. The hybrid MHC I complexed with heterologous &#946;2-microglobulin (&#946;2m) substitution from different species can be stabilized in vitro. This is a feasible means to study MHC I of mammals, when the homologous &#946;2m is not available. Meanwhile, it is indicated that mammalian &#946;2m substitution does not significantly affect peptide presentation. However, there is limited summarization regarding the methodology and the technology for the hybrid MHC I complexed with heterologous &#946;2-microglobulin (&#946;2m). Herein, methods to evaluate the feasibility of heterologous &#946;2m substitution in MHC I study are presented. These methods include preparation of expression constructs; purification of inclusion bodies and refolding of the MHC complex; determination of protein thermostability; crystal screening and structure determination. This study provides a recommendation for understanding function and structure of MHC I, and is also significant for T cell response evaluation during infectious disease and tumor immunotherapy.

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &#946;2-Microglobulin

The protocol describes experimental methods to obtain stable major histocompatibility complex (MHC) class I through potential &#946;2-microglobulin (&#946;2m) substitutions from different species. The structural comparison of MHC I stabilized by homologous and heterologous &#946;2m were investigated.

Stabilität und Struktur der Fledermaus Haupt Histokompatibilität Komplex Klasse I mit heterologen β2-Mikroglobulin

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...