Questo lavoro è stato supportato da NIA R00 AG053412 (KEF).

Tutte le procedure sono state eseguite nel rispetto delle raccomandazioni contenute nella Guida alla cura e all'uso degli animali da laboratorio degli Istituti Nazionali di Salute e secondo i Principi Guida Internazionali per la Ricerca Biomedica che coinvolge gli Animali. Il protocollo è stato approvato dall'Università della Carolina del Nord presso il Charlotte Institutional Animal Care and Use Committee (Protocol #19-020).
1. Prepararsi alla cultura
NOTA: Queste procedure devono essere fatte in condizioni sterili in un armadio di biosicurezza designato per la coltura tissutale. Cfr. tabella 1 per i supporti e le soluzioni.
<ol><li>Sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione autoclave in sacchetti di sterilizzazione autosigillanti.</li>
	<li>Preparare scorte di lavoro di poli-D-lisina per il trattamento di piatti di coltura a 12 porvili.<ol>
<li>Sciogliere la poli-D-lisina in 1x tampone di borato a una concentrazione di 100 μg/mL (10x concentrato). Conservare circa 1 mL di aliquote a -20 °C fino a quando necessario.</li>
		<li>Diluire la poli-D-lsina concentrata 10x in dPBS a 10 μg/mL (1x) e sterilizzare il filtro.</li>
		<li>Trattare piastre di coltura a 12 po porsi con 0,5 mL per pozzo di 1 poli-D-lisina a temperatura ambiente per almeno 1 h o durante la notte per l'uso il giorno successivo. Assicurarsi che il volume di poli-D-llysina sia sufficiente per coprire completamente il fondo dell'area di coltura.</li>
		<li>Appena prima dell'uso, rimuovere la poli-D-lisina dalla piastra di coltura, risciacquare 3 volte in acqua sterile e conservare in acqua sterile fino a quando non è pronto per placcare le cellule. Rimuovere tutte le tracce di liquido da un'aspirazione approfondita prima di placcare le cellule.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare neuron growth media e tampone FACS. Filtrare sterilizzare e conservare a 4 °C fino all'uso. Neuron Growth Media può essere conservato per circa 2 wks; Il buffer FACS può essere mantenuto per circa 4 wks.</li>
</ol>2. Sezionare l'ippocampo embrionale
NOTA: Questa procedura può essere eseguita sul banco in quanto richiede l'uso di un microscopio stereo per la rimozione di meningi e microdissezione dell'ippocampo. Aderire a una rigorosa tecnica aseptica per ridurre al minimo la potenziale contaminazione.
<ol><li>Eutanasia un topo femmina C57BL/6J incinta a tempo al giorno 18 embrionale in una camera di CO2.</li>
	<li>Spruzzare la pelle addominale e la pelliccia con il 70% di EtOH, quindi pizzicare la pelle con le forcelle tissutali e fare una piccola incisione con forbici chirurgiche. Incise il peritoneo per esporre i visceri e l'utero.</li>
	<li>Afferrare l'utero con force standard, sollevare dalla cavità e tagliare la connessione al mesometrio con forbici fini. Trasferire l'utero con embrioni in un piatto sterile di coltura plastica da 100 mm posto sul ghiaccio.</li>
	<li>Usando forbici fini e forcep fini, tagliare con cura l'utero e rimuovere le sacche embrionali per rilasciare embrioni. Trasferire gli embrioni in un nuovo piatto sterile da coltura plastica da 100 mm contenente dPBS posto sul ghiaccio.</li>
	<li>Decapitare i cuccioli embrionali usando forbici fini e trasferire le teste al nuovo piatto di coltura plastica sterile da 100 mm contenente mezzo Hibernate-E posto sul ghiaccio.</li>
	<li>Per rimuovere il cervello, tenere la testa con un paio di forcep fini in una mano. Usando le forcep dumont #7 curve, invece, inserisci la punta delle forcep alla base del cranio e pizzica l'osso e sovrasta la pelle muovendosi anteriormente lungo la linea mediana senza perforare il cervello.</li>
	<li>L'uso di forcep curve separa la pelle e il cranio per esporre il cervello. Spazzare le forcep curve sotto il cervello dal bulbo olfattivo esposto al cervelletto per sollevare il cervello dal cranio. Trasferire il cervello in un nuovo piatto sterile da coltura plastica da 100 mm contenente mezzo Hibernate-E posto sul ghiaccio. Ripeti per ogni cervello. NOTA: Tutti i cervelli possono essere raccolti in un unico piatto di coltura a meno che non sia necessario essere separati per scopi specifici dell'esperimento.</li>
	<li>Al microscopio a dissezione stereo, lavorando con un cervello alla volta e due paia di piumini dumont #5 sterili, pizzicare i bulbi olfattivi e tirare via le meningi. Una rimozione completa delle meningi è necessaria per evitare la contaminazione della coltura da parte di altre cellule e per consentire un'ulteriore dissezione.</li>
	<li>Una volta rimosse correttamente le meningi, il lato superiore della corteccia si apre lateralmente, il che esporrà l'ippocampo. Usando le #5 Dumont, pizzicare l'ippocampo lontano dalla corteccia attaccata e trasferire con cura l'ippocampo isolato in un tubo conico sterile da 15 ml contenente 5 ml di mezzo ibernato-E sul ghiaccio.</li>
	<li>Ripetere la dissezione per entrambi gli emisferi cerebrali per ogni cucciolo di topo embrionale e combinare tutti gli ippocampi in un unico tubo conico da 15 ml, a meno che non sia necessario separatamente per scopi specifici dell'esperimento.<ol>
<li>Per coltura dei neuroni corticali, la corteccia può essere separata dalla sottocorteccia ed elaborata in modo identico ai neuroni ippocampali. NOTA: A questo punto, il protocollo potrebbe essere messo in pausa. Conservare cervelli o ippocampi sezionati in hibernate-e medium integrati con B27 (2%) a 4 °C per un massimo di 1 mese, anche se un ritardo prolungato può compromettere il numero di cellule vitali.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Dissociare e coltivare i neuroni ippocampali
NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili in un armadio di biosicurezza designato per la coltura tissutale.
<ol><li>Preparare 0,5 mL di soluzione di dissociazione della papaina per embrione per la dissociazione ippocampale. Il volume della soluzione di dissociazione necessaria varierà a seconda del numero di cervelli embrionali sezionati. NOTA: Per la coltura corticale dei neuroni, preparare 1,0 mL di soluzione di papaina per embrione.<ol>
<li>Sciogliere 20 μL di sospensione di papaina per 1 mL del mezzo Hibernate E con vortice per circa 3 min.</li>
		<li>Dopo lo scioglimento della papaina, aggiungere 1 μL di DNasi I per 1 mL della soluzione. Non vortice la soluzione dopo la DNasi I è stato aggiunto in quanto questo può disattivare l'enzima.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tubo conico centrifugato da 15 ml contenente tessuto ippocampale (fase 2.10) a 1.000 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante e aggiungere la soluzione di papaina. Rimorsi il tessuto invertendo più volte. Incubare a 37 °C per 30 minuti, invertendo per rimorsi il tessuto ogni 10 minuti.<ol>
<li>Se si coltivano neuroni corticali, trasferire tutte le cortici in un nuovo piatto di coltura sterile da 100 mm, aspirare accuratamente i mezzi dalla piastra e il tessuto tritacanza con forbici sottili o lamette da barba. Aggiungere la soluzione di papaina al piatto di coltura e trasferire il tessuto corticale con soluzione di papaina in un tubo conico da 15 ml utilizzando una pipetta di trasferimento sterile. Incubare tessuti e soluzione enzimatica a 37 °C per 30 min, agitando ogni 10 minuti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Durante l'incubazione di 30 minuti, preparare 3 pipette Pasteur in vetro lucidato dal fuoco: 1 completamente aperto, 1 mezzo aperto e 1 quarto aperto.</li>
	<li>Dopo l'incubazione di 30 minuti, centrifugare il tubo conico da 15 ml contenente tessuti cerebrali digeriti a 125 x g per 10 minuti. Rimuovere la soluzione enzimatica e sostituirla con un volume uguale di mezzo fresco Ibernato E.</li>
	<li>Utilizzando pipetta Pasteur completamente aperta, triturare il tessuto 10x. Lasciare depositare il tessuto per 2 minuti, quindi trasferire la sospensione cellulare supernatante in un tubo conico sterile da 50 ml. Aggiungere un volume uguale di mezzo Ibernato E al tessuto.</li>
	<li>Utilizzando pipetta Pasteur semiapra, tessuto triturato 10x. Lasciare depositare il tessuto per 2 minuti, quindi trasferire la sospensione cellulare supernatante nello stesso tubo conico da 50 ml come nella fase precedente. Aggiungere un volume uguale di mezzo Ibernato E al tessuto.</li>
	<li>Utilizzando pipetta Pasteur quarti aperta, tessuto triturato 10x. Lasciare che il tessuto si accontenti di 2 minuti, quindi trasferire nuovamente la sospensione cellulare supernatante allo stesso conico da 50 mL dei passaggi precedenti. Scartare qualsiasi tessuto rimanente che non si sia dissociato.</li>
	<li>Centrifugare il tubo conico da 50 ml contenente il supernatante dalla sospensione cellulare a 125 x g per 5 min. Se non è già fatto, lavare piastre rivestite in poli-D-llysina con acqua sterile e rimuovere tutte le tracce di liquido per aspirazione approfondita durante la centrifugazione.</li>
	<li>Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 5 mL di Neuron Growth Media. Contare le cellule vive usando tripano blu ed emocitometro.<ol>
<li>Se si coltivano neuroni corticali, aggiungere almeno 10 mL di neuron growth media per cellule meno dense e conteggio più accurato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diluire le cellule con neuron growth media per una densità di placcatura finale di 5 x 105 cellule vitali per ml e aggiungere 1 ml di sospensione cellulare diluita ad ogni pozzo di una piastra di 12 pozza. Mantenere i neuroni a 37 °C con il 5% di CO2. NOTA: Tipicamente, gli ippocampi di 1 cervello di topo embrionale, cioè 2 ippocampi, producono circa 1 x 106 cellule vitali. Questo numero è fornito solo a scopo di pianificazione sperimentale e non deve essere considerato una sostituzione per il conteggio delle celle per ogni coltura.</li>
	<li>Cambia i mezzi di crescita il giorno dopo la coltura rimuovendo metà del volume dei media da ogni pozzo, cioè 0,5 mL, e aggiungi un volume uguale di nuovi supporti sul lato del pozzo per evitare di interrompere le cellule coltivate. Completa i semi-supporti due volte alla settimana per la durata della cultura.</li>
</ol>4. Valutazione dell'espressione MHCI per citometria del flusso
<ol><li>Preparare il trattamento diluire l'interferone beta (IFNβ) o un volume uguale di diluente nei media di crescita neuronali. Poiché il cambiamento dei media sarà un cambiamento di mezzo volume, preparare i mezzi di trattamento con IFNβ concentrato 2x. cioè, per trattare 3 pozzi di una piastra di 12 pozzali con 100 U/mL di IFNβ, preparare 1,5 mL con 200 U/mL IFNβ o e uguale volume di diluente IFNβ per i controlli trattati con supporti.</li>
	<li>Rimuovere 0,5 mL da ogni pozzo di neuroni e aggiungere 0,5 mL di neuron growth media con o senza IFNβ ad ogni pozzo. Incubare in condizioni di crescita normale (37 °C, 5% CO2) per 6-72 ore, a seconda delle condizioni sperimentali e dell'ottimizzazione del segnale.</li>
	<li>Dopo il tempo di trattamento, rimuovere tutti i mezzi di coltura e lavare delicatamente una volta in mezzi neurobasali freddi privi di integratori (B27, L-glutammina, Pen-Strep).</li>
	<li>Aggiungere 0,5 mL di mezzi neurobasali freddi non integrati contenenti 1 μg/mL di blocco Fc e 1 μg/mL di anticorpo fluorescente coniugato anti-MHCI per ogni pozzo. Incubare a 4 °C protetto dalla luce per 45 minuti.</li>
	<li>Rimuovere i mezzi contenenti anticorpi e lavare con cura una volta in dPBS freddo. Aggiungere un tampone di dissociazione cellulare privo di enzimi a temperatura ambiente di 0,5 mL ad ogni pozzo e agitare per spodedare le cellule. Guarda la dissociazione usando il microscopio a coltura tissutale invertita.</li>
	<li>Una volta che le cellule sono staccate dal piatto di coltura, aggiungere 0,5 ml di tampone FACS a ogni pozzo, cellule triturate per disperdere i grumi e trasferire il volume totale di ogni pozzo a singoli tubi di microcentrifugo da 1,7 ml.</li>
	<li>Centrifuga a 1.000 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante, rimescolare il pellet cellulare in 100 μL di tampone FACS e trasferire il volume totale di ciascun tubo in singoli pozzi di una piastra inferiore a U da 96 pozzoli.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di reagente fissivo ad ogni pozzo. Triturare più volte per evitare che le cellule si aggloppino e incubano per 15 minuti a temperatura ambiente protette dalla luce.</li>
	<li>Centrifuga a 500 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante e resuspend in 200 μl di tampone FACS.</li>
	<li>Centrifuga a 500 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante e il resopend in 100 μL di reagente di permeabilizzazione contenente anticorpo anti-NeuN coniugato fluorescente (diluizione 1:100) ad ogni pozzo. Mescolare bene, quindi incubare a temperatura ambiente protetta dalla luce con dondolo per 20 minuti.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, centrifugare a 500 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante e resuspend in 100 μL di tampone FACS. Ripetere 2x.</li>
	<li>Dopo il lavaggio finale, resuspend cellule in 100 μL di paraformaldeide al 2% diluite nel tampone FACS. Mescolare bene per evitare che le cellule si aggloppino. Conservare a 4 °C protetti dalla luce fino a quando non sono pronti per la lettura su un citometro a flusso. Leggere i campioni il prima possibile, entro 1 settimana.</li>
</ol>5. Quantificare e valutare i dati
<ol><li>Misurare i controlli di compensazione per ogni colorante fluorescente e correggere eventuali sovrapposizioni spettrali. I controlli di compensazione ideali includono neuroni coltivati che non sono contaminati, macchiati solo con anti-MHCI e macchiati solo di anti-NeuN.</li>
	<li>Se possibile, registrare 100.000 eventi per ogni esempio (almeno 10.000) e salvarli come file FCS.</li>
	<li>Per analizzare i dati, utilizzando un software di analisi appropriato, impostare cancelli sequenziali, come illustrato nella figura 1A-C da selezionare per i neuroni positivi alla NeuN.<ol>
<li>Plottare SSC-A (log) vs FSC-A (lineare). Disegnare un cancello sulla popolazione cellulare (P1) per eliminare i detriti cellulari dall'analisi.</li>
		<li>All'interno della popolazione cellulare P1, tracciare FSC-H (lineare) vs FSC-A (lineare). Disegna un cancello sulla popolazione di singole cellule.</li>
		<li>All'interno della popolazione a cella singola, tracciare SSC-A (log) vs NeuN (log). Disegna un cancello sulla popolazione neun-positiva usando celle macchiate non macchiate o solo MHCI come guida.</li>
		<li>Traccia un istogramma della fluorescenza MHCI con eventi cellulari normalizzati in modalità sull'asse y. Usando neuroni macchiati non macchiati o solo NeuN come guida, disegna un cancello orizzontale per quantificare la percentuale di neuroni positivi per mhci.</li>
		<li>Esportare la percentuale di cellule positive per mhci, così come l'intensità mediana di fluorescenza (IFM) per MHCI sulla popolazione neun-positiva per la valutazione statistica e il disegno grafico.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Galea, I., Bechmann, I., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+immune+privilege+(not).">What is immune privilege (not).</a> Trends in Immunology. 28 (1), 12-18 (2007).</li><li>Morimoto, K., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Immune+System+in+the+Development+of+the+Central+Nervous+System.">Role of the Immune System in the Development of the Central Nervous System.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 916 (2019).</li><li>Klein, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+During+RNA+Viral+Infections.">Neuroinflammation During RNA Viral Infections.</a> Annual Review of Immunology. 37, 73-95 (2019).</li><li>Janeway, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T+cell+receptor+as+a+multicomponent+signalling+machine:+CD4/CD8+coreceptors+and+CD45+in+T+cell+activation.">The T cell receptor as a multicomponent signalling machine: CD4/CD8 coreceptors and CD45 in T cell activation.</a> Annual Review of Immunology. 10, 645-674 (1992).</li><li>Peaper, D. R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+MHC+class+I+assembly+and+peptide+binding.">Regulation of MHC class I assembly and peptide binding.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 24, 343-368 (2008).</li><li>Donaldson, J. G., Williams, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Assembly+and+Trafficking+of+MHC+Class+I+Molecules.">Intracellular Assembly and Trafficking of MHC Class I Molecules.</a> Traffic. 10 (12), 1745-1752 (2009).</li><li>Charles, A., Janeway, J., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell-mediated+cytotoxicity.">T cell-mediated cytotoxicity.</a> Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition. , (2001).</li><li>Guidotti, L. G., Chisari, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncytolytic+control+of+viral+infections+by+the+innate+and+adaptive+immune+response.">Noncytolytic control of viral infections by the innate and adaptive immune response.</a> Annual Review of Immunology. 19, 65-91 (2001).</li><li>Chevalier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+are+MHC+class+I-dependent+targets+for+CD8+T+cells+upon+neurotropic+viral+infection.">Neurons are MHC class I-dependent targets for CD8 T cells upon neurotropic viral infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (11), 1002393 (2011).</li><li>Shrestha, B., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CD8++T+Cells+in+Control+of+West+Nile+Virus+Infection.">Role of CD8+ T Cells in Control of West Nile Virus Infection.</a> Journal of Virology. 78 (15), 8312-8321 (2004).</li><li>Plaisted, W. C., Weinger, J. G., Walsh, C. M., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+mediated+suppression+of+neurotropic+coronavirus+replication+in+neural+precursor+cells.">T cell mediated suppression of neurotropic coronavirus replication in neural precursor cells.</a> Virology. 449, 235-243 (2014).</li><li>Marten, N. W., Stohlman, S. A., Zhou, J., Bergmann, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+virus-specific+CD8++-T-cell+expansion+and+trafficking+following+central+nervous+system+infection.">Kinetics of virus-specific CD8+ -T-cell expansion and trafficking following central nervous system infection.</a> Journal of Virology. 77 (4), 2775-2778 (2003).</li><li>Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+I:+an+unexpected+role+in+neuronal+plasticity.">MHC class I: an unexpected role in neuronal plasticity.</a> Neuron. 64 (1), 40-45 (2009).</li><li>Corriveau, R. A., Huh, G. S., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+class+I+MHC+gene+expression+in+the+developing+and+mature+CNS+by+neural+activity.">Regulation of class I MHC gene expression in the developing and mature CNS by neural activity.</a> Neuron. 21 (3), 505-520 (1998).</li><li>Goddard, C. A., Butts, D. A., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CNS+synapses+by+neuronal+MHC+class+I.">Regulation of CNS synapses by neuronal MHC class I.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (16), 6828-6833 (2007).</li><li>Needleman, L. A., Liu, X. B., El-Sabeawy, F., Jones, E. G., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+I+molecules+are+present+both+pre-+and+postsynaptically+in+the+visual+cortex+during+postnatal+development+and+in+adulthood.">MHC class I molecules are present both pre- and postsynaptically in the visual cortex during postnatal development and in adulthood.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (39), 16999-17004 (2010).</li><li>Syken, J., Grandpre, T., Kanold, P. O., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PirB+restricts+ocular-dominance+plasticity+in+visual+cortex.">PirB restricts ocular-dominance plasticity in visual cortex.</a> Science. 313 (5794), 1795-1800 (2006).</li><li>Atwal, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PirB+is+a+functional+receptor+for+myelin+inhibitors+of+axonal+regeneration.">PirB is a functional receptor for myelin inhibitors of axonal regeneration.</a> Science. 322 (5903), 967-970 (2008).</li><li>Takai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+immunoglobulin-like+receptors+and+their+MHC+class+I+recognition.">Paired immunoglobulin-like receptors and their MHC class I recognition.</a> Immunology. 115 (4), 433-440 (2005).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+elimination+and+learning+rules+co-regulated+by+MHC+class+I+H2-Db.">Synapse elimination and learning rules co-regulated by MHC class I H2-Db.</a> Nature. 509 (7499), 195-200 (2014).</li><li>Ribic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+regulation+of+MHC+class+I+expression+in+the+developing+primary+visual+cortex+of+the+common+marmoset+monkey.">Activity-dependent regulation of MHC class I expression in the developing primary visual cortex of the common marmoset monkey.</a> Behavioral and Brain Functions. 7, 1 (2011).</li><li>Sahu, M. P., Nikkil&#228;, O., L&#229;gas, S., Kolehmainen, S., Castr&#233;n, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+primary+neurons+from+rat+hippocampus+and+cortex.">Culturing primary neurons from rat hippocampus and cortex.</a> Neuronal Signaling. 3 (2), (2019).</li><li>Gordon, J., Amini, S., White, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+overview+of+neuronal+cell+culture.">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).</li><li>Zhang, X., Hu, D., Shang, Y., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+induced+pluripotent+stem+cell+neuronal+models+to+study+neurodegenerative+diseases.">Using induced pluripotent stem cell neuronal models to study neurodegenerative diseases.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1866 (4), 165431 (2020).</li><li>Berry, B. J., Smith, A. S. T., Young, J. E., Mack, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+Current+Challenges+Associated+with+the+Use+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Modeling+Neurodegenerative+Disease.">Advances and Current Challenges Associated with the Use of Human Induced Pluripotent Stem Cells in Modeling Neurodegenerative Disease.</a> Cells, Tissues, Organs. 205 (5-6), 331-349 (2018).</li><li>Ho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Single-Cell+Transcriptomics+in+Adult+Rodent+Brain:+The+Medium+Spiny+Neuron+Transcriptome+Revisited.">A Guide to Single-Cell Transcriptomics in Adult Rodent Brain: The Medium Spiny Neuron Transcriptome Revisited.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 159 (2018).</li><li>Panchision, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Flow+Cytometric+Analysis+of+Central+Nervous+System+Tissue+Reveals+Novel+Functional+Relationships+Among+Cells+Expressing+CD133,+CD15,+and+CD24.">Optimized Flow Cytometric Analysis of Central Nervous System Tissue Reveals Novel Functional Relationships Among Cells Expressing CD133, CD15, and CD24.</a> Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).</li><li>Snaidero, N., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+at+a+glance.">Myelination at a glance.</a> Journal of Cell Science. 127 (14), 2999-3004 (2014).</li><li>Martin, D., Xu, J., Porretta, C., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurocytometry:+Flow+Cytometric+Sorting+of+Specific+Neuronal+Populations+from+Human+and+Rodent+Brain.">Neurocytometry: Flow Cytometric Sorting of Specific Neuronal Populations from Human and Rodent Brain.</a> ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 356-367 (2017).</li><li>Lv, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+MHC+Class+I+Expression+Is+Regulated+by+Activity+Driven+Calcium+Signaling.">Neuronal MHC Class I Expression Is Regulated by Activity Driven Calcium Signaling.</a> PLoS One. 10 (8), 0135223 (2015).</li><li>Barco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+facilitated+L-LTP+in+VP16-CREB+mice+reveals+that+BDNF+is+critical+for+the+maintenance+of+LTP+and+its+synaptic+capture.">Gene expression profiling of facilitated L-LTP in VP16-CREB mice reveals that BDNF is critical for the maintenance of LTP and its synaptic capture.</a> Neuron. 48 (1), 123-137 (2005).</li><li>Glynn, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHCI+negatively+regulates+synapse+density+during+the+establishment+of+cortical+connections.">MHCI negatively regulates synapse density during the establishment of cortical connections.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 442-451 (2011).</li><li>Facci, L., Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Rodent+Cortical,+Hippocampal,+and+Striatal+Neurons.">Culture of Rodent Cortical, Hippocampal, and Striatal Neurons.</a> Methods Molecular Biology. 1727, 39-47 (2018).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo descrive la dissezione e la coltura dei neuroni ippocampali primari dai cuccioli di topo prenatale al giorno 18 embrionale. L'uso di neuroni primari coltivati da roditori è una delle metodologie più fondamentali sviluppate nella neurobiologia moderna22. Sebbene le linee cellulari immortalate possano modellare alcuni aspetti dei neuroni, la loro natura di cellule derivate dal tumore, l'incapacità di sviluppare assoni definiti e la continua divisione cellulare sollevano dubbi sul fatto che ricapitolano fedelmente le proprietà dei neuroni post-mitotici in vivo23. Un'altra alternativa ai neuroni primari è l'uso di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (IPSC). La tecnologia per l'utilizzo degli HiPSC, in particolare quelli derivati dal paziente, è prolisse rapidamente negli ultimianni 24. Tuttavia, ci sono ancora limitazioni all'utilizzo degli HiPSC, tra cui variabilità tra linee cellulari, mancanza di maturità funzionale e differenze nei profili epigenetici25. Sebbene ci siano anche limiti al lavoro con il modello riduzionista dei neuroni roditori primari, i neuroni coltivati mantengono la natura post-mitotica dei neuroni in vivo. Inoltre, gli ampi strumenti di biologia molecolare e le modifiche genetiche disponibili per i topi favoriscono l'uso dei neuroni primari rispetto agli IPSC per molte applicazioni, e gli studi sui topi possono essere facilmente tradotti nell'organismo in vivo più complesso senza perdere il sistema genetico sperimentale. Per questi motivi, molti ricercatori usano i neuroni roditori primari per verificare gli aspetti chiave, se non la maggior parte, della loro ricerca.
Per alcuni saggi, i neuroni possono essere analizzati direttamente dopo l'isolamento dal cervello ex vivo. Ciò è particolarmente auspicabile per gli esperimenti che coinvolgono topi adulti che possono essere sottoposti a specifiche condizioni sperimentali o che possono dipendere da interazioni di più tipi di cellule; tuttavia, ci sono diversi problemi che limitano il tipo di analisi che possono essere fatte. È tecnicamente difficile preparare una sospensione a singola cellula dei neuroni dal cervello dei topi adulti perché i neuroni sono interconnessi in modo univoco ed etnea dalla mielina26. I metodi non enzimatici di triturazione tissutale sono inefficienti nel dissociare il tessuto e causano la morte cellulare, mentre i preparati enzimatici spesso scindono gli antigeni superficialicellulari 27. Inoltre, mentre la mielina è in gran parte assente dai topi embrionali, comprende circa il 20% del cervello adulto e può compromettere l'isolamento cellulare vitale e impedire l'analisi della citometria delflusso 28. Molte delle tecniche che sono state sviluppate alla fine spogliano i neuroni del loro citosolo e lasciano piccoli corpi cellulari arrotondati che consistono principalmente di nuclei29. Sebbene ciò sia accettabile per alcune analisi, questo non è appropriato per quantificare l'espressione citoplasmatica o extracellulare delle proteine. Inoltre, il sistema di coltura cellulare riduzionista consente di testare specifiche domande meccaniche su una scala di tempo più breve di quanto sia spesso possibile con un sistema in vivo.
In questo protocollo sono descritti anche metodi per stimolare l'espressione MHCI farmacologicamente con IFNβ e la quantificazione dell'espressione MHCI extracellulare per citometria del flusso. La stimolazione da parte dell'IFNβ è un utile controllo positivo per testare altre condizioni sperimentali, ma si può notare che IFNγ e l'acido kainico possono anche stimolare l'espressione MHCI nei neuroni9,30, mentre la tetrodotossina diminuisce l'espressione MHCI14. Metodi precedenti per rilevare l'espressione MHCI si basavano sull'ibridazione in situ e sull'analisi immunoistochimica14,15,20,31. Mentre i test basati sull'mRNA, come l'ibridazione in situ e il qRT-PCR, possono determinare la localizzazione spaziotemporale, la specificità del tipo di cellula e i livelli di trascrizione genica, questi test non possono valutare la traduzione o il trasporto delle proteine nella membrana plasmatica. L'analisi immunoistochimica e western blot può determinare le differenze nell'espressione proteica e nella localizzazione potenzialmente cellulare, ma può essere difficile da quantificare con precisione. Inoltre, molti anticorpi MHCI riconoscono la struttura terziaria del complesso e sono altamente sensibili ai cambiamenti conformazionali. Pertanto, le condizioni di permeabilizzazione o denaturazione potrebbero causare la perdita di immunoreattività MHCI32. Il metodo qui presentato utilizza l'immunostaining in situ per MHCI, che consente il riconoscimento della proteina da parte dell'anticorpo nella sua conformazione nativa, seguita da metodi di fissazione e permeabilizzazione.
Con lievi modifiche, i metodi qui descritti possono essere utilizzati per coltura di altre popolazioni neuronali o per valutare l'espressione di altre proteine extracellulari di interesse. Notato in questo protocollo sono facili modifiche che possono essere fatte al fine di coltura neuroni corticali, ma i metodi descritti qui possono anche essere utilizzati per coltura di altre popolazioni neuronali, come i neuroni striatoli33. Inoltre, sebbene questo protocollo specifichi l'immunostaining di MHCI e NeuN, altri marcatori cellulari possono essere identificati in modo simile. In generale, i marcatori extracellulari possono essere trattati come MHCI e i marcatori intracellulari possono essere trattati come NeuN. Tuttavia, va notato che durante la fase di dissociazione cellulare, le proiezioni assonali vengono recise dal soma. Poiché la strategia di gating definita qui scherma i detriti cellulari e si concentra sul marcatore dei nuclei neuronali NeuN, le proteine che sono espresse esclusivamente nelle proiezioni assonali potrebbero non essere rilevate.
Fino a poco tempo fa, si pensava che i neuroni esprimessero MHCI solo in risposta a danni, infezioni o stimolazione citochina in vitro al fine di coinvolgere cellule citotossiche CD8+ T9. Una nuova ricerca ha chiarito un'altra funzione dell'MHCI nella regolazione delle connessioni sinaptiche durante lo sviluppo13. Il protocollo qui descritto utilizza IFNβ per stimolare l'espressione MHCI nei neuroni coltivati a tipo selvatico, ma metodi simili possono essere usati con una varietà di stimoli cellulari o modifiche genetiche per testare ipotesi specifiche. Questo metodo consentirà ai ricercatori di studiare i meccanismi molecolari che regolano l'espressione MHCI, che miglioreranno la comprensione del ruolo dicotomo dell'MHCI su queste due distinte funzioni cellulari.

Un tempo si pensava che il sistema nervoso centrale (SNC) fosse privo di sorveglianza immunitaria, indicato come "immuneprivilegiato 1". Ora è chiaro che questo privilegio non equivale all'assoluta assenza di componenti immunitari, ma piuttosto a una regolazione specializzata che funzioni per limitare il danno associato all'immunopatologia1. Infatti, la comunicazione tra il SNC e il sistema immunitario è una conversazione in corso necessaria per uno sviluppo cerebrale sano e la risposta alleinfezioni 2,3.
Le principali molecole di classe I (MHCI) complesse di istocompatibilità sono proteine transmembrana poligeniche e polimorfiche meglio conosciute per la loro funzione nel presentare peptidi antigenici alle cellule CD8+ T durante l'infezione4. I complessi MHCI classici consistono in una catena α transmembrana e una catena di luce extracellulare, chiamata β2-microglobulina. La α contiene una scanalatura polimorfica che lega un peptide antigenico per la presentazione5. La corretta espressione di MHCI sulla membrana extracellulare richiede un'azione coordinata di chaperoni molecolari al reticolo endoplasmatico per garantire una corretta piegatura della catena α e β2-microglobulina insieme al caricamento di un ligando peptidico ad alta affinità5. Solo una volta assemblati i complessi MHCI, vengono esportati dal reticolo endoplasmatico alla membrana plasmatica6. Al momento dell'innesto del recettore delle cellule T affini con il complesso MHCI caricato peptidico, le cellule CD8+ T mediano l'uccisione cellulare rilasciando granuli litici contenenti perforina e granzimi o inducendo apoptosi attraverso il legame del recettore Fas sulla membrana cellulare bersaglio7. Inoltre, le cellule CD8+ T producono citochine, come l'interferone gamma (IFNγ) e il fattore di necrosi tumorale alfa (TNFα), che può attivare meccanismi antivirali nelle cellule infette senza effetti citopatici8,9. Per molti virus neurotropi, le cellule CD8+ T sono necessarie per cancellare l'infezione dal SNC10,11,12.
In precedenza si pensava che i neuroni esprimessero MHCI solo in condizioni di danno, infezione virale o con stimolazione citochina in vitro. Recentemente, la ricerca ha identificato un ruolo per l'espressione neuronale di MHCI nel rimodellamento sinaptico e nellaplasticità 13,14. Sebbene i meccanismi precisi alla base della regolazione della sinapsi non siano ben compresi, i dati indicano che il livello di espressione MHCI è regolato dall'attivitàsinaptica 15,16. Un'ipotesi ipotizza che i neuroni esprimano il recettore B (PirB) accoppiato come immunoglobulina, che lega l'MHCI trasnapticamente13,17. Questa interazione avvia una cascata di segnalazione da parte di PirB che si oppone ai percorsi coinvolti nel rimodellamento sinaptico, rafforzando e stabilizzando così la connessione sinaptica17,18,19. In assenza di attività neuronale, l'espressione MHCIè diminuita di 14e la perdita di MHCI si traduce in eliminazione sinapsi difettosa e circuiti sinaptici disorganizzati20,21.
Il saggio qui descritto, che è stato adattato da Chevalier etal. Questo protocollo illustra le tecniche iniziali per microdissesecare il tessuto ippocampale dai cuccioli di topo embrionali. Vengono quindi dettagli i processi per la dissociazione enzimatica e meccanica del tessuto in un'unica sospensione cellulare e i metodi per mantenere le colture in vitro. Poiché non si dividono, una volta che sono in coltura, i neuroni devono essere placcati in un piatto e una densità adatti al loro endpoint sperimentale. Successivamente, delinea i passaggi per indurre l'espressione MHCI con interferone beta (IFNβ), l'immunoetichettatura per MHCI e il marcatore di nuclei neuronali NeuN e l'analisi delle cellule per citometria del flusso. Infine, descrive le procedure per valutare i dati della citometria del flusso per identificare i neuroni mhci-positivi e quantificare il livello dell'espressione MHCI. In questo protocollo sono anche annotate piccole regolazioni che possono essere fatte per coltura di neuroni corticali in aggiunta o al posto dei neuroni ippocampali. Questo protocollo può essere facilmente modificato per testare ipotesi specifiche utilizzando variazioni genetiche o trattamenti farmacologici.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm sterile culture dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB012924</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Centrifuge Tubes</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>21-103</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>21-108</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mM EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>FACS Buffer Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP82031Gal</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U-bottom plate</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-221</td>
			<td>Flow Cytometry Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borate Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28341</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Pasteur Pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13 678 20C</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Dissociation Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13 151 014</td>
			<td>Flow Cytometry Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>90083</td>
			<td>Dissociation Solution Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-235</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91113-10</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fix and Perm Cell Permeabilization Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>GAS003</td>
			<td>Flow Cytometry Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate-E Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1247601</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Sealing Sterilization Pouches</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>181254</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon Beta</td>
			<td>PBL Assay Science</td>
			<td>12405-1</td>
			<td>Flow Cytometry Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Mark Anti-NeuN-PE Antibody, clone A60</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>FCMAB317PE</td>
			<td>Flow Cytometry Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse H-2Kb Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116513</td>
			<td>Flow Cytometry Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Solution</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>Dissociation Solution Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Pattern Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91100-12</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo dissection microscope</td>
			<td>Swift</td>
			<td>M29TZ-SM99CL-BTW1</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91401-10</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipets</td>
			<td>Corning</td>
			<td>357575</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101319</td>
			<td>Flow Cytometry Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the expression of major histocompatibility complex class i on primary murine hippocampal neurons by flow cytometry

L'aumento delle evidenze supporta l'ipotesi che le interazioni neuro-immunitarie impartino sulla funzione del sistema nervoso sia in condizioni omeostatiche che patologiche. Una funzione ben studiata del principale complesso di istocompatibilità classe I (MHCI) è la presentazione di peptidi derivati dalle cellule al sistema immunitario adattivo, in particolare in risposta alle infezioni. Più recentemente è stato dimostrato che l'espressione delle molecole di MHCI sui neuroni può modulare i cambiamenti dipendenti dall'attività nella connettività sinaptica durante il normale sviluppo e disturbi neurologici. L'importanza di queste funzioni per la salute del cervello supporta la necessità di un saggio sensibile che rilevi prontamente l'espressione MHCI sui neuroni. Qui descriviamo un metodo per la coltura primaria dei neuroni ippocampali murini e quindi la valutazione dell'espressione MHCI mediante analisi citometrica del flusso. L'ippocampo murino viene microdissecato dai cuccioli di topo prenatale al giorno 18 embrionale. Il tessuto viene dissociato in una singola sospensione cellulare utilizzando tecniche enzimatiche e meccaniche, quindi coltivate in un supporto privo di siero che limita la crescita delle cellule non neuronali. Dopo 7 giorni in vitro, l'espressione MHCI viene stimolata trattando le cellule coltivate farmacologicamente con interferone beta. Le molecole di MHCI sono etichettate in situ con un anticorpo marcato fluorescentmente, quindi le cellule vengono dissociate non enzimaticamente in una singola sospensione cellulare. Per confermare l'identità neuronale, le cellule sono fissate con paraformaldeide, permeabilizzate ed etichettate con un anticorpo taggato fluorescentmente che riconosce l'antigene nucleare neuronale NeuN. L'espressione MHCI viene quindi quantificata sui neuroni mediante analisi citometrica del flusso. Le colture neuronali possono essere facilmente manipolate da modifiche genetiche o interventi farmacologici per testare ipotesi specifiche. Con lievi modifiche, questi metodi possono essere utilizzati per coltura di altre popolazioni neuronali o per valutare l'espressione di altre proteine di interesse.

Utilizzando la procedura qui presentata, il tessuto ippocampale è stato sezionato dai cuccioli di topo prenatale al giorno 18 embrionale. Il tessuto è stato dissociato in una singola sospensione cellulare utilizzando metodi enzimatici e meccanici, quindi coltivati in 12 piastre pozzate che sono state pretrattate con poli-D-lisina. Dopo 7 giorni in vitro, le cellule sono state trattate con 100 U/mL di IFNβ o mezzi solo per 72 h, il che ha stimolato l'espressione di MHCI. I neuroni sono stati macchiati in situ per MHCI prima di essere dissociati non enzimaticamente in una singola sospensione cellulare. I neuroni sono stati fissati e permeabili, quindi macchiati intracellularmente per il marcatore dei nuclei neuronali NeuN. I campioni sono stati valutati per citometria del flusso e i dati sono stati analizzati utilizzando il software associato. I neuroni sono stati identificati attraverso la gating sequenziale degli eventi totali per escludere detriti cellulari e doppietti (Figura 1A,B). I neuroni sono stati definitivamente identificati dalla positività NeuN(Figura 1C). Le cellule NeuN+ sono state ulteriormente analizzate per la positività MHCI tracciando le cellule su un istogramma con il numero di cellule normalizzate alla modalità sull'asse y e la fluorescenza MHCI sull'asse x. Un MHCI+ gate è stato disegnato nel punto in cui i picchi positivi e negativi divergevano (Figura 1D). Da ciò, la percentuale di neuroni positivi per la colorazione MHCI (Figura 1E) e l'intensità mediana della fluorescenza (IFM; Figura 1F) sono stati calcolati. I risultati mostrano che il trattamento IFNβ ha significativamente migliorato la percentuale di neuroni positivi per la colorazione extracellulare dell'MHCI, così come il livello di espressione, come indicato dalle IFM. L'analisi statistica e la rappresentazione grafica sono state fatte utilizzando software statistico disponibile in commercio.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61436/61436fig1v2.jpg"> Figura 1: Strategia rappresentativa di gating e quantificazione MHCI. I neuroni ippocampali primari sono stati trattati con 100 U/mL di IFNβ o solo media. Dopo 72 ore, i neuroni sono stati macchiati extracellularmente con MHCI coniugato con blu del Pacifico (1 μg / mL H2-Kb), quindi etichettati intracellularmente con NeuN coniugato in PE (diluizione 1:100). La fluorescenza cellulare è stata valutata dalla citometria del flusso e sono stati analizzati i dati. (A) Gli eventi totali sono stati tracciati come SSC-A (log) vs FSC-A (lineare) e le celle (P1) sono state gateed per escludere i detriti. (B) All'interno della popolazione P1, le cellule sono state tracciate come FSC-H (lineari) vs FSC-A (lineari) per gateare la popolazione di singole cellule. (C) All'interno della popolazione di singole celle, le celle sono state tracciate SSC-A (log) vs NeuN-PE (log). Le cellule NeuN+ sono state gated per identificare i neuroni. (D) All'interno della popolazione neuronale, le cellule sono state tracciate su un istogramma con MHCI-PacBlu sull'asse x e i numeri cellulari normalizzati in modalità sull'asse y. È stato disegnato un cancello orizzontale per quantificare la percentuale di neuroni positivi per la colorazione MHCI. (E) Quantificazione della percentuale di MHCI+ di NeuN+ cellule solo nei mezzi e neuroni trattati con IFNβ. (F) Quantificazione dell'intensità mediana di fluorescenza (IFM) di MHCI su NeuN+ cellule nei neuroni mediali (neri) e trattati con IFNβ (rosso). La significatività statistica è stata calcolata mediante test t non accoppiato. **, P < 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61436/61436fig1v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Neuron Growth Media (50 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
			<td>Concentrazione stock</td>
			<td>Per 50 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Supplemento B27</td>
			<td>2%</td>
			<td>100%</td>
			<td>1,0 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutammina</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>200 mM</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penicillina-Streptomicina</td>
			<td>100 U/ml</td>
			<td>10.000 U/ml</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mezzi neurobasali</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>48,0 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Tampone FACS (500 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
			<td>Concentrazione stock</td>
			<td>Per 500 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Siero bovino fetale</td>
			<td>2%</td>
			<td>100%</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Edta</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>500 mM</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>DPBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>489 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Soluzione di dissociazione con papaina</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
			<td>Concentrazione stock</td>
			<td>Per 1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sospensione papaina</td>
			<td>20 U/ml</td>
			<td>1000 U/ml</td>
			<td>0,020 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNasi I</td>
			<td>2,5 U/ml</td>
			<td>2500 U/ml</td>
			<td>0,001 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ibernazione-E</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1,0 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Nota: Il volume della soluzione di dissociazione della papaina necessaria varierà a seconda del numero di cervelli embrionali sezionati. Preparare 0,5 ml per cervello per i neuroni ippocampali o 1,0 ml per cervello per i neuroni corticali.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Nota: Preparare la soluzione di dissociazione vortexing sospensione di papaina in Ibernato-E per circa 3 min. Dopo che la papaina è stata completamente sciolta, aggiungere la DNasi I. Non vortice DNasi I.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Media e soluzioni.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry at JoVE.com

Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Questo protocollo descrive un metodo per coltivare i neuroni ippocampali primari dal cervello embrionale del topo. L'espressione del complesso di istocompatibilità principale di classe I sulla superficie extracellulare dei neuroni coltivati viene quindi valutata mediante analisi citometrica del flusso.

Valutazione dell'espressione del complesso di istocompatibilità maggiore classe I sui neuroni ippocampali murini primari per citometria a flusso

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A ...

assessing-expression-major-histocompatibility-complex-class-i-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

3.3K Views.  University of North Carolina at Charlotte. Questo protocollo descrive un metodo per coltivare i neuroni ippocampali primari dal cervello embrionale del topo. L'espressione del complesso di istocompatibilità principale di classe I sulla superficie extracellulare dei neuroni coltivati viene quindi valutata mediante analisi citometrica del flusso.

Video: Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Analisi Citometria a flusso di cellule immunitarie all&#39;interno aorte Murine

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Umano In Vitro</emSoppressione> come strumento di screening per il riconoscimento di uno Stato precoce di squilibrio immunitario

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Rilevamento di nanoparticelle fluorescenti Interazioni con Primaria immunitario sottopopolazioni cellulari mediante citometria di flusso

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

In Situ Rilevamento di Autoreattivi CD4 cellule T nel cervello e nel cuore Utilizzo Maggiore di Istocompatibilità Dextramers classe Complex II

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

Caratterizzazione fenotipica dei macrofagi dal rene di ratto mediante citometria di flusso

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Separazione delle cellule fluorescenza-attivato per la purificazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi dal midollo osseo di topo

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

La valutazione della retina microglia fagocitaria Funzione<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando un test citometria a flusso basato su

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Basato sulla fluorescenza neuraminidasi Inibizione Assay per valutare la suscettibilità dei virus influenzali di neuraminidasi Inhibitor classe di antivirali

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

Caratterizzazione dei sottoinsiemi di monociti umani da sangue intero flusso Cytometry analisi

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...