Questo lavoro è stato supportato da NIA R00 AG053412 (KEF).

Tutte le procedure sono state eseguite nel rispetto delle raccomandazioni contenute nella Guida alla cura e all'uso degli animali da laboratorio degli Istituti Nazionali di Salute e secondo i Principi Guida Internazionali per la Ricerca Biomedica che coinvolge gli Animali. Il protocollo è stato approvato dall'Università della Carolina del Nord presso il Charlotte Institutional Animal Care and Use Committee (Protocol #19-020).
1. Prepararsi alla cultura
NOTA: Queste procedure devono essere fatte in condizioni sterili in un armadio di biosicurezza designato per la coltura tissutale. Cfr. tabella 1 per i supporti e le soluzioni.
<ol><li>Sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione autoclave in sacchetti di sterilizzazione autosigillanti.</li>
	<li>Preparare scorte di lavoro di poli-D-lisina per il trattamento di piatti di coltura a 12 porvili.<ol>
<li>Sciogliere la poli-D-lisina in 1x tampone di borato a una concentrazione di 100 μg/mL (10x concentrato). Conservare circa 1 mL di aliquote a -20 °C fino a quando necessario.</li>
		<li>Diluire la poli-D-lsina concentrata 10x in dPBS a 10 μg/mL (1x) e sterilizzare il filtro.</li>
		<li>Trattare piastre di coltura a 12 po porsi con 0,5 mL per pozzo di 1 poli-D-lisina a temperatura ambiente per almeno 1 h o durante la notte per l'uso il giorno successivo. Assicurarsi che il volume di poli-D-llysina sia sufficiente per coprire completamente il fondo dell'area di coltura.</li>
		<li>Appena prima dell'uso, rimuovere la poli-D-lisina dalla piastra di coltura, risciacquare 3 volte in acqua sterile e conservare in acqua sterile fino a quando non è pronto per placcare le cellule. Rimuovere tutte le tracce di liquido da un'aspirazione approfondita prima di placcare le cellule.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare neuron growth media e tampone FACS. Filtrare sterilizzare e conservare a 4 °C fino all'uso. Neuron Growth Media può essere conservato per circa 2 wks; Il buffer FACS può essere mantenuto per circa 4 wks.</li>
</ol>2. Sezionare l'ippocampo embrionale
NOTA: Questa procedura può essere eseguita sul banco in quanto richiede l'uso di un microscopio stereo per la rimozione di meningi e microdissezione dell'ippocampo. Aderire a una rigorosa tecnica aseptica per ridurre al minimo la potenziale contaminazione.
<ol><li>Eutanasia un topo femmina C57BL/6J incinta a tempo al giorno 18 embrionale in una camera di CO2.</li>
	<li>Spruzzare la pelle addominale e la pelliccia con il 70% di EtOH, quindi pizzicare la pelle con le forcelle tissutali e fare una piccola incisione con forbici chirurgiche. Incise il peritoneo per esporre i visceri e l'utero.</li>
	<li>Afferrare l'utero con force standard, sollevare dalla cavità e tagliare la connessione al mesometrio con forbici fini. Trasferire l'utero con embrioni in un piatto sterile di coltura plastica da 100 mm posto sul ghiaccio.</li>
	<li>Usando forbici fini e forcep fini, tagliare con cura l'utero e rimuovere le sacche embrionali per rilasciare embrioni. Trasferire gli embrioni in un nuovo piatto sterile da coltura plastica da 100 mm contenente dPBS posto sul ghiaccio.</li>
	<li>Decapitare i cuccioli embrionali usando forbici fini e trasferire le teste al nuovo piatto di coltura plastica sterile da 100 mm contenente mezzo Hibernate-E posto sul ghiaccio.</li>
	<li>Per rimuovere il cervello, tenere la testa con un paio di forcep fini in una mano. Usando le forcep dumont #7 curve, invece, inserisci la punta delle forcep alla base del cranio e pizzica l'osso e sovrasta la pelle muovendosi anteriormente lungo la linea mediana senza perforare il cervello.</li>
	<li>L'uso di forcep curve separa la pelle e il cranio per esporre il cervello. Spazzare le forcep curve sotto il cervello dal bulbo olfattivo esposto al cervelletto per sollevare il cervello dal cranio. Trasferire il cervello in un nuovo piatto sterile da coltura plastica da 100 mm contenente mezzo Hibernate-E posto sul ghiaccio. Ripeti per ogni cervello. NOTA: Tutti i cervelli possono essere raccolti in un unico piatto di coltura a meno che non sia necessario essere separati per scopi specifici dell'esperimento.</li>
	<li>Al microscopio a dissezione stereo, lavorando con un cervello alla volta e due paia di piumini dumont #5 sterili, pizzicare i bulbi olfattivi e tirare via le meningi. Una rimozione completa delle meningi è necessaria per evitare la contaminazione della coltura da parte di altre cellule e per consentire un'ulteriore dissezione.</li>
	<li>Una volta rimosse correttamente le meningi, il lato superiore della corteccia si apre lateralmente, il che esporrà l'ippocampo. Usando le #5 Dumont, pizzicare l'ippocampo lontano dalla corteccia attaccata e trasferire con cura l'ippocampo isolato in un tubo conico sterile da 15 ml contenente 5 ml di mezzo ibernato-E sul ghiaccio.</li>
	<li>Ripetere la dissezione per entrambi gli emisferi cerebrali per ogni cucciolo di topo embrionale e combinare tutti gli ippocampi in un unico tubo conico da 15 ml, a meno che non sia necessario separatamente per scopi specifici dell'esperimento.<ol>
<li>Per coltura dei neuroni corticali, la corteccia può essere separata dalla sottocorteccia ed elaborata in modo identico ai neuroni ippocampali. NOTA: A questo punto, il protocollo potrebbe essere messo in pausa. Conservare cervelli o ippocampi sezionati in hibernate-e medium integrati con B27 (2%) a 4 °C per un massimo di 1 mese, anche se un ritardo prolungato può compromettere il numero di cellule vitali.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Dissociare e coltivare i neuroni ippocampali
NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili in un armadio di biosicurezza designato per la coltura tissutale.
<ol><li>Preparare 0,5 mL di soluzione di dissociazione della papaina per embrione per la dissociazione ippocampale. Il volume della soluzione di dissociazione necessaria varierà a seconda del numero di cervelli embrionali sezionati. NOTA: Per la coltura corticale dei neuroni, preparare 1,0 mL di soluzione di papaina per embrione.<ol>
<li>Sciogliere 20 μL di sospensione di papaina per 1 mL del mezzo Hibernate E con vortice per circa 3 min.</li>
		<li>Dopo lo scioglimento della papaina, aggiungere 1 μL di DNasi I per 1 mL della soluzione. Non vortice la soluzione dopo la DNasi I è stato aggiunto in quanto questo può disattivare l'enzima.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tubo conico centrifugato da 15 ml contenente tessuto ippocampale (fase 2.10) a 1.000 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante e aggiungere la soluzione di papaina. Rimorsi il tessuto invertendo più volte. Incubare a 37 °C per 30 minuti, invertendo per rimorsi il tessuto ogni 10 minuti.<ol>
<li>Se si coltivano neuroni corticali, trasferire tutte le cortici in un nuovo piatto di coltura sterile da 100 mm, aspirare accuratamente i mezzi dalla piastra e il tessuto tritacanza con forbici sottili o lamette da barba. Aggiungere la soluzione di papaina al piatto di coltura e trasferire il tessuto corticale con soluzione di papaina in un tubo conico da 15 ml utilizzando una pipetta di trasferimento sterile. Incubare tessuti e soluzione enzimatica a 37 °C per 30 min, agitando ogni 10 minuti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Durante l'incubazione di 30 minuti, preparare 3 pipette Pasteur in vetro lucidato dal fuoco: 1 completamente aperto, 1 mezzo aperto e 1 quarto aperto.</li>
	<li>Dopo l'incubazione di 30 minuti, centrifugare il tubo conico da 15 ml contenente tessuti cerebrali digeriti a 125 x g per 10 minuti. Rimuovere la soluzione enzimatica e sostituirla con un volume uguale di mezzo fresco Ibernato E.</li>
	<li>Utilizzando pipetta Pasteur completamente aperta, triturare il tessuto 10x. Lasciare depositare il tessuto per 2 minuti, quindi trasferire la sospensione cellulare supernatante in un tubo conico sterile da 50 ml. Aggiungere un volume uguale di mezzo Ibernato E al tessuto.</li>
	<li>Utilizzando pipetta Pasteur semiapra, tessuto triturato 10x. Lasciare depositare il tessuto per 2 minuti, quindi trasferire la sospensione cellulare supernatante nello stesso tubo conico da 50 ml come nella fase precedente. Aggiungere un volume uguale di mezzo Ibernato E al tessuto.</li>
	<li>Utilizzando pipetta Pasteur quarti aperta, tessuto triturato 10x. Lasciare che il tessuto si accontenti di 2 minuti, quindi trasferire nuovamente la sospensione cellulare supernatante allo stesso conico da 50 mL dei passaggi precedenti. Scartare qualsiasi tessuto rimanente che non si sia dissociato.</li>
	<li>Centrifugare il tubo conico da 50 ml contenente il supernatante dalla sospensione cellulare a 125 x g per 5 min. Se non è già fatto, lavare piastre rivestite in poli-D-llysina con acqua sterile e rimuovere tutte le tracce di liquido per aspirazione approfondita durante la centrifugazione.</li>
	<li>Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 5 mL di Neuron Growth Media. Contare le cellule vive usando tripano blu ed emocitometro.<ol>
<li>Se si coltivano neuroni corticali, aggiungere almeno 10 mL di neuron growth media per cellule meno dense e conteggio più accurato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diluire le cellule con neuron growth media per una densità di placcatura finale di 5 x 105 cellule vitali per ml e aggiungere 1 ml di sospensione cellulare diluita ad ogni pozzo di una piastra di 12 pozza. Mantenere i neuroni a 37 °C con il 5% di CO2. NOTA: Tipicamente, gli ippocampi di 1 cervello di topo embrionale, cioè 2 ippocampi, producono circa 1 x 106 cellule vitali. Questo numero è fornito solo a scopo di pianificazione sperimentale e non deve essere considerato una sostituzione per il conteggio delle celle per ogni coltura.</li>
	<li>Cambia i mezzi di crescita il giorno dopo la coltura rimuovendo metà del volume dei media da ogni pozzo, cioè 0,5 mL, e aggiungi un volume uguale di nuovi supporti sul lato del pozzo per evitare di interrompere le cellule coltivate. Completa i semi-supporti due volte alla settimana per la durata della cultura.</li>
</ol>4. Valutazione dell'espressione MHCI per citometria del flusso
<ol><li>Preparare il trattamento diluire l'interferone beta (IFNβ) o un volume uguale di diluente nei media di crescita neuronali. Poiché il cambiamento dei media sarà un cambiamento di mezzo volume, preparare i mezzi di trattamento con IFNβ concentrato 2x. cioè, per trattare 3 pozzi di una piastra di 12 pozzali con 100 U/mL di IFNβ, preparare 1,5 mL con 200 U/mL IFNβ o e uguale volume di diluente IFNβ per i controlli trattati con supporti.</li>
	<li>Rimuovere 0,5 mL da ogni pozzo di neuroni e aggiungere 0,5 mL di neuron growth media con o senza IFNβ ad ogni pozzo. Incubare in condizioni di crescita normale (37 °C, 5% CO2) per 6-72 ore, a seconda delle condizioni sperimentali e dell'ottimizzazione del segnale.</li>
	<li>Dopo il tempo di trattamento, rimuovere tutti i mezzi di coltura e lavare delicatamente una volta in mezzi neurobasali freddi privi di integratori (B27, L-glutammina, Pen-Strep).</li>
	<li>Aggiungere 0,5 mL di mezzi neurobasali freddi non integrati contenenti 1 μg/mL di blocco Fc e 1 μg/mL di anticorpo fluorescente coniugato anti-MHCI per ogni pozzo. Incubare a 4 °C protetto dalla luce per 45 minuti.</li>
	<li>Rimuovere i mezzi contenenti anticorpi e lavare con cura una volta in dPBS freddo. Aggiungere un tampone di dissociazione cellulare privo di enzimi a temperatura ambiente di 0,5 mL ad ogni pozzo e agitare per spodedare le cellule. Guarda la dissociazione usando il microscopio a coltura tissutale invertita.</li>
	<li>Una volta che le cellule sono staccate dal piatto di coltura, aggiungere 0,5 ml di tampone FACS a ogni pozzo, cellule triturate per disperdere i grumi e trasferire il volume totale di ogni pozzo a singoli tubi di microcentrifugo da 1,7 ml.</li>
	<li>Centrifuga a 1.000 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante, rimescolare il pellet cellulare in 100 μL di tampone FACS e trasferire il volume totale di ciascun tubo in singoli pozzi di una piastra inferiore a U da 96 pozzoli.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di reagente fissivo ad ogni pozzo. Triturare più volte per evitare che le cellule si aggloppino e incubano per 15 minuti a temperatura ambiente protette dalla luce.</li>
	<li>Centrifuga a 500 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante e resuspend in 200 μl di tampone FACS.</li>
	<li>Centrifuga a 500 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante e il resopend in 100 μL di reagente di permeabilizzazione contenente anticorpo anti-NeuN coniugato fluorescente (diluizione 1:100) ad ogni pozzo. Mescolare bene, quindi incubare a temperatura ambiente protetta dalla luce con dondolo per 20 minuti.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, centrifugare a 500 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante e resuspend in 100 μL di tampone FACS. Ripetere 2x.</li>
	<li>Dopo il lavaggio finale, resuspend cellule in 100 μL di paraformaldeide al 2% diluite nel tampone FACS. Mescolare bene per evitare che le cellule si aggloppino. Conservare a 4 °C protetti dalla luce fino a quando non sono pronti per la lettura su un citometro a flusso. Leggere i campioni il prima possibile, entro 1 settimana.</li>
</ol>5. Quantificare e valutare i dati
<ol><li>Misurare i controlli di compensazione per ogni colorante fluorescente e correggere eventuali sovrapposizioni spettrali. I controlli di compensazione ideali includono neuroni coltivati che non sono contaminati, macchiati solo con anti-MHCI e macchiati solo di anti-NeuN.</li>
	<li>Se possibile, registrare 100.000 eventi per ogni esempio (almeno 10.000) e salvarli come file FCS.</li>
	<li>Per analizzare i dati, utilizzando un software di analisi appropriato, impostare cancelli sequenziali, come illustrato nella figura 1A-C da selezionare per i neuroni positivi alla NeuN.<ol>
<li>Plottare SSC-A (log) vs FSC-A (lineare). Disegnare un cancello sulla popolazione cellulare (P1) per eliminare i detriti cellulari dall'analisi.</li>
		<li>All'interno della popolazione cellulare P1, tracciare FSC-H (lineare) vs FSC-A (lineare). Disegna un cancello sulla popolazione di singole cellule.</li>
		<li>All'interno della popolazione a cella singola, tracciare SSC-A (log) vs NeuN (log). Disegna un cancello sulla popolazione neun-positiva usando celle macchiate non macchiate o solo MHCI come guida.</li>
		<li>Traccia un istogramma della fluorescenza MHCI con eventi cellulari normalizzati in modalità sull'asse y. Usando neuroni macchiati non macchiati o solo NeuN come guida, disegna un cancello orizzontale per quantificare la percentuale di neuroni positivi per mhci.</li>
		<li>Esportare la percentuale di cellule positive per mhci, così come l'intensità mediana di fluorescenza (IFM) per MHCI sulla popolazione neun-positiva per la valutazione statistica e il disegno grafico.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo descrive la dissezione e la coltura dei neuroni ippocampali primari dai cuccioli di topo prenatale al giorno 18 embrionale. L'uso di neuroni primari coltivati da roditori è una delle metodologie più fondamentali sviluppate nella neurobiologia moderna22. Sebbene le linee cellulari immortalate possano modellare alcuni aspetti dei neuroni, la loro natura di cellule derivate dal tumore, l'incapacità di sviluppare assoni definiti e la continua divisione cellulare sollevano dubbi sul fatto che ricapitolano fedelmente le proprietà dei neuroni post-mitotici in vivo23. Un'altra alternativa ai neuroni primari è l'uso di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (IPSC). La tecnologia per l'utilizzo degli HiPSC, in particolare quelli derivati dal paziente, è prolisse rapidamente negli ultimianni 24. Tuttavia, ci sono ancora limitazioni all'utilizzo degli HiPSC, tra cui variabilità tra linee cellulari, mancanza di maturità funzionale e differenze nei profili epigenetici25. Sebbene ci siano anche limiti al lavoro con il modello riduzionista dei neuroni roditori primari, i neuroni coltivati mantengono la natura post-mitotica dei neuroni in vivo. Inoltre, gli ampi strumenti di biologia molecolare e le modifiche genetiche disponibili per i topi favoriscono l'uso dei neuroni primari rispetto agli IPSC per molte applicazioni, e gli studi sui topi possono essere facilmente tradotti nell'organismo in vivo più complesso senza perdere il sistema genetico sperimentale. Per questi motivi, molti ricercatori usano i neuroni roditori primari per verificare gli aspetti chiave, se non la maggior parte, della loro ricerca.
Per alcuni saggi, i neuroni possono essere analizzati direttamente dopo l'isolamento dal cervello ex vivo. Ciò è particolarmente auspicabile per gli esperimenti che coinvolgono topi adulti che possono essere sottoposti a specifiche condizioni sperimentali o che possono dipendere da interazioni di più tipi di cellule; tuttavia, ci sono diversi problemi che limitano il tipo di analisi che possono essere fatte. È tecnicamente difficile preparare una sospensione a singola cellula dei neuroni dal cervello dei topi adulti perché i neuroni sono interconnessi in modo univoco ed etnea dalla mielina26. I metodi non enzimatici di triturazione tissutale sono inefficienti nel dissociare il tessuto e causano la morte cellulare, mentre i preparati enzimatici spesso scindono gli antigeni superficialicellulari 27. Inoltre, mentre la mielina è in gran parte assente dai topi embrionali, comprende circa il 20% del cervello adulto e può compromettere l'isolamento cellulare vitale e impedire l'analisi della citometria delflusso 28. Molte delle tecniche che sono state sviluppate alla fine spogliano i neuroni del loro citosolo e lasciano piccoli corpi cellulari arrotondati che consistono principalmente di nuclei29. Sebbene ciò sia accettabile per alcune analisi, questo non è appropriato per quantificare l'espressione citoplasmatica o extracellulare delle proteine. Inoltre, il sistema di coltura cellulare riduzionista consente di testare specifiche domande meccaniche su una scala di tempo più breve di quanto sia spesso possibile con un sistema in vivo.
In questo protocollo sono descritti anche metodi per stimolare l'espressione MHCI farmacologicamente con IFNβ e la quantificazione dell'espressione MHCI extracellulare per citometria del flusso. La stimolazione da parte dell'IFNβ è un utile controllo positivo per testare altre condizioni sperimentali, ma si può notare che IFNγ e l'acido kainico possono anche stimolare l'espressione MHCI nei neuroni9,30, mentre la tetrodotossina diminuisce l'espressione MHCI14. Metodi precedenti per rilevare l'espressione MHCI si basavano sull'ibridazione in situ e sull'analisi immunoistochimica14,15,20,31. Mentre i test basati sull'mRNA, come l'ibridazione in situ e il qRT-PCR, possono determinare la localizzazione spaziotemporale, la specificità del tipo di cellula e i livelli di trascrizione genica, questi test non possono valutare la traduzione o il trasporto delle proteine nella membrana plasmatica. L'analisi immunoistochimica e western blot può determinare le differenze nell'espressione proteica e nella localizzazione potenzialmente cellulare, ma può essere difficile da quantificare con precisione. Inoltre, molti anticorpi MHCI riconoscono la struttura terziaria del complesso e sono altamente sensibili ai cambiamenti conformazionali. Pertanto, le condizioni di permeabilizzazione o denaturazione potrebbero causare la perdita di immunoreattività MHCI32. Il metodo qui presentato utilizza l'immunostaining in situ per MHCI, che consente il riconoscimento della proteina da parte dell'anticorpo nella sua conformazione nativa, seguita da metodi di fissazione e permeabilizzazione.
Con lievi modifiche, i metodi qui descritti possono essere utilizzati per coltura di altre popolazioni neuronali o per valutare l'espressione di altre proteine extracellulari di interesse. Notato in questo protocollo sono facili modifiche che possono essere fatte al fine di coltura neuroni corticali, ma i metodi descritti qui possono anche essere utilizzati per coltura di altre popolazioni neuronali, come i neuroni striatoli33. Inoltre, sebbene questo protocollo specifichi l'immunostaining di MHCI e NeuN, altri marcatori cellulari possono essere identificati in modo simile. In generale, i marcatori extracellulari possono essere trattati come MHCI e i marcatori intracellulari possono essere trattati come NeuN. Tuttavia, va notato che durante la fase di dissociazione cellulare, le proiezioni assonali vengono recise dal soma. Poiché la strategia di gating definita qui scherma i detriti cellulari e si concentra sul marcatore dei nuclei neuronali NeuN, le proteine che sono espresse esclusivamente nelle proiezioni assonali potrebbero non essere rilevate.
Fino a poco tempo fa, si pensava che i neuroni esprimessero MHCI solo in risposta a danni, infezioni o stimolazione citochina in vitro al fine di coinvolgere cellule citotossiche CD8+ T9. Una nuova ricerca ha chiarito un'altra funzione dell'MHCI nella regolazione delle connessioni sinaptiche durante lo sviluppo13. Il protocollo qui descritto utilizza IFNβ per stimolare l'espressione MHCI nei neuroni coltivati a tipo selvatico, ma metodi simili possono essere usati con una varietà di stimoli cellulari o modifiche genetiche per testare ipotesi specifiche. Questo metodo consentirà ai ricercatori di studiare i meccanismi molecolari che regolano l'espressione MHCI, che miglioreranno la comprensione del ruolo dicotomo dell'MHCI su queste due distinte funzioni cellulari.

Un tempo si pensava che il sistema nervoso centrale (SNC) fosse privo di sorveglianza immunitaria, indicato come "immuneprivilegiato 1". Ora è chiaro che questo privilegio non equivale all'assoluta assenza di componenti immunitari, ma piuttosto a una regolazione specializzata che funzioni per limitare il danno associato all'immunopatologia1. Infatti, la comunicazione tra il SNC e il sistema immunitario è una conversazione in corso necessaria per uno sviluppo cerebrale sano e la risposta alleinfezioni 2,3.
Le principali molecole di classe I (MHCI) complesse di istocompatibilità sono proteine transmembrana poligeniche e polimorfiche meglio conosciute per la loro funzione nel presentare peptidi antigenici alle cellule CD8+ T durante l'infezione4. I complessi MHCI classici consistono in una catena α transmembrana e una catena di luce extracellulare, chiamata β2-microglobulina. La α contiene una scanalatura polimorfica che lega un peptide antigenico per la presentazione5. La corretta espressione di MHCI sulla membrana extracellulare richiede un'azione coordinata di chaperoni molecolari al reticolo endoplasmatico per garantire una corretta piegatura della catena α e β2-microglobulina insieme al caricamento di un ligando peptidico ad alta affinità5. Solo una volta assemblati i complessi MHCI, vengono esportati dal reticolo endoplasmatico alla membrana plasmatica6. Al momento dell'innesto del recettore delle cellule T affini con il complesso MHCI caricato peptidico, le cellule CD8+ T mediano l'uccisione cellulare rilasciando granuli litici contenenti perforina e granzimi o inducendo apoptosi attraverso il legame del recettore Fas sulla membrana cellulare bersaglio7. Inoltre, le cellule CD8+ T producono citochine, come l'interferone gamma (IFNγ) e il fattore di necrosi tumorale alfa (TNFα), che può attivare meccanismi antivirali nelle cellule infette senza effetti citopatici8,9. Per molti virus neurotropi, le cellule CD8+ T sono necessarie per cancellare l'infezione dal SNC10,11,12.
In precedenza si pensava che i neuroni esprimessero MHCI solo in condizioni di danno, infezione virale o con stimolazione citochina in vitro. Recentemente, la ricerca ha identificato un ruolo per l'espressione neuronale di MHCI nel rimodellamento sinaptico e nellaplasticità 13,14. Sebbene i meccanismi precisi alla base della regolazione della sinapsi non siano ben compresi, i dati indicano che il livello di espressione MHCI è regolato dall'attivitàsinaptica 15,16. Un'ipotesi ipotizza che i neuroni esprimano il recettore B (PirB) accoppiato come immunoglobulina, che lega l'MHCI trasnapticamente13,17. Questa interazione avvia una cascata di segnalazione da parte di PirB che si oppone ai percorsi coinvolti nel rimodellamento sinaptico, rafforzando e stabilizzando così la connessione sinaptica17,18,19. In assenza di attività neuronale, l'espressione MHCIè diminuita di 14e la perdita di MHCI si traduce in eliminazione sinapsi difettosa e circuiti sinaptici disorganizzati20,21.
Il saggio qui descritto, che è stato adattato da Chevalier etal. Questo protocollo illustra le tecniche iniziali per microdissesecare il tessuto ippocampale dai cuccioli di topo embrionali. Vengono quindi dettagli i processi per la dissociazione enzimatica e meccanica del tessuto in un'unica sospensione cellulare e i metodi per mantenere le colture in vitro. Poiché non si dividono, una volta che sono in coltura, i neuroni devono essere placcati in un piatto e una densità adatti al loro endpoint sperimentale. Successivamente, delinea i passaggi per indurre l'espressione MHCI con interferone beta (IFNβ), l'immunoetichettatura per MHCI e il marcatore di nuclei neuronali NeuN e l'analisi delle cellule per citometria del flusso. Infine, descrive le procedure per valutare i dati della citometria del flusso per identificare i neuroni mhci-positivi e quantificare il livello dell'espressione MHCI. In questo protocollo sono anche annotate piccole regolazioni che possono essere fatte per coltura di neuroni corticali in aggiunta o al posto dei neuroni ippocampali. Questo protocollo può essere facilmente modificato per testare ipotesi specifiche utilizzando variazioni genetiche o trattamenti farmacologici.

<table><tbody><tr><td>1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td>Laboratory Supplies</td></tr><tr><td>100 mm sterile culture dish</td><td>Fisher</td><td>FB012924</td><td>Tissue Culture Supplies</td></tr><tr><td>15 ml Centrifuge Tubes</td><td>Genesee</td><td>21-103</td><td>Laboratory Supplies</td></tr><tr><td>50 ml centrifuge tube</td><td>Genesee</td><td>21-108</td><td>Laboratory Supplies</td></tr><tr><td>500 mM EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td>FACS Buffer Reagent</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Fisher</td><td>BP82031Gal</td><td>Tissue Culture Supplies</td></tr><tr><td>96 well U-bottom plate</td><td>Genesee</td><td>25-221</td><td>Flow Cytometry Supplies</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Neuron Culture Reagent</td></tr><tr><td>Borate Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>28341</td><td>Tissue Culture Supplies</td></tr><tr><td>Borosilicate Glass Pasteur Pipette</td><td>Fisher</td><td>13 678 20C</td><td>Laboratory Supplies</td></tr><tr><td>Cell Dissociation Buffer</td><td>Gibco</td><td>13 151 014</td><td>Flow Cytometry Supplies</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Thermo</td><td>90083</td><td>Dissociation Solution Reagent</td></tr><tr><td>dPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-235</td><td>Tissue Culture Supplies</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>Dissection Tool</td></tr><tr><td>Dumont #7 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91197-00</td><td>Dissection Tool</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td>Tissue Culture Supplies</td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91113-10</td><td>Dissection Tool</td></tr><tr><td>Fine Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td>Dissection Tool</td></tr><tr><td>Fix and Perm Cell Permeabilization Kit</td><td>Invitrogen</td><td>GAS003</td><td>Flow Cytometry Supplies</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Neuron Culture Reagent</td></tr><tr><td>Hibernate-E Medium</td><td>Gibco</td><td>A1247601</td><td>Neuron Culture Reagent</td></tr><tr><td>Instant Sealing Sterilization Pouches</td><td>Fisher</td><td>181254</td><td>Tissue Culture Supplies</td></tr><tr><td>Interferon Beta</td><td>PBL Assay Science</td><td>12405-1</td><td>Flow Cytometry Supplies</td></tr><tr><td>Milli-Mark Anti-NeuN-PE Antibody, clone A60</td><td>MilliporeSigma</td><td>FCMAB317PE</td><td>Flow Cytometry Antibody</td></tr><tr><td>Neurobasal Media</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Neuron Culture Reagent</td></tr><tr><td>Pacific Blue anti-mouse H-2Kb Antibody</td><td>BioLegend</td><td>116513</td><td>Flow Cytometry Antibody</td></tr><tr><td>Papain Solution</td><td>Worthington</td><td>LS003126</td><td>Dissociation Solution Reagent</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>Fixative</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Neuron Culture Reagent</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td>Neuron Culture Reagent</td></tr><tr><td>Standard Pattern Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91100-12</td><td>Dissection Tool</td></tr><tr><td>Stereo dissection microscope</td><td>Swift</td><td>M29TZ-SM99CL-BTW1</td><td>Dissection Tool</td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91401-10</td><td>Dissection Tool</td></tr><tr><td>Transfer Pipets</td><td>Corning</td><td>357575</td><td>Laboratory Supplies</td></tr><tr><td>TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody</td><td>BioLegend</td><td>101319</td><td>Flow Cytometry Antibody</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154-100ML</td><td>Tissue Culture Supplies</td></tr></tbody></table>

assessing the expression of major histocompatibility complex class i on primary murine hippocampal neurons by flow cytometry

L'aumento delle evidenze supporta l'ipotesi che le interazioni neuro-immunitarie impartino sulla funzione del sistema nervoso sia in condizioni omeostatiche che patologiche. Una funzione ben studiata del principale complesso di istocompatibilità classe I (MHCI) è la presentazione di peptidi derivati dalle cellule al sistema immunitario adattivo, in particolare in risposta alle infezioni. Più recentemente è stato dimostrato che l'espressione delle molecole di MHCI sui neuroni può modulare i cambiamenti dipendenti dall'attività nella connettività sinaptica durante il normale sviluppo e disturbi neurologici. L'importanza di queste funzioni per la salute del cervello supporta la necessità di un saggio sensibile che rilevi prontamente l'espressione MHCI sui neuroni. Qui descriviamo un metodo per la coltura primaria dei neuroni ippocampali murini e quindi la valutazione dell'espressione MHCI mediante analisi citometrica del flusso. L'ippocampo murino viene microdissecato dai cuccioli di topo prenatale al giorno 18 embrionale. Il tessuto viene dissociato in una singola sospensione cellulare utilizzando tecniche enzimatiche e meccaniche, quindi coltivate in un supporto privo di siero che limita la crescita delle cellule non neuronali. Dopo 7 giorni in vitro, l'espressione MHCI viene stimolata trattando le cellule coltivate farmacologicamente con interferone beta. Le molecole di MHCI sono etichettate in situ con un anticorpo marcato fluorescentmente, quindi le cellule vengono dissociate non enzimaticamente in una singola sospensione cellulare. Per confermare l'identità neuronale, le cellule sono fissate con paraformaldeide, permeabilizzate ed etichettate con un anticorpo taggato fluorescentmente che riconosce l'antigene nucleare neuronale NeuN. L'espressione MHCI viene quindi quantificata sui neuroni mediante analisi citometrica del flusso. Le colture neuronali possono essere facilmente manipolate da modifiche genetiche o interventi farmacologici per testare ipotesi specifiche. Con lievi modifiche, questi metodi possono essere utilizzati per coltura di altre popolazioni neuronali o per valutare l'espressione di altre proteine di interesse.

Utilizzando la procedura qui presentata, il tessuto ippocampale è stato sezionato dai cuccioli di topo prenatale al giorno 18 embrionale. Il tessuto è stato dissociato in una singola sospensione cellulare utilizzando metodi enzimatici e meccanici, quindi coltivati in 12 piastre pozzate che sono state pretrattate con poli-D-lisina. Dopo 7 giorni in vitro, le cellule sono state trattate con 100 U/mL di IFNβ o mezzi solo per 72 h, il che ha stimolato l'espressione di MHCI. I neuroni sono stati macchiati in situ per MHCI prima di essere dissociati non enzimaticamente in una singola sospensione cellulare. I neuroni sono stati fissati e permeabili, quindi macchiati intracellularmente per il marcatore dei nuclei neuronali NeuN. I campioni sono stati valutati per citometria del flusso e i dati sono stati analizzati utilizzando il software associato. I neuroni sono stati identificati attraverso la gating sequenziale degli eventi totali per escludere detriti cellulari e doppietti (Figura 1A,B). I neuroni sono stati definitivamente identificati dalla positività NeuN(Figura 1C). Le cellule NeuN+ sono state ulteriormente analizzate per la positività MHCI tracciando le cellule su un istogramma con il numero di cellule normalizzate alla modalità sull'asse y e la fluorescenza MHCI sull'asse x. Un MHCI+ gate è stato disegnato nel punto in cui i picchi positivi e negativi divergevano (Figura 1D). Da ciò, la percentuale di neuroni positivi per la colorazione MHCI (Figura 1E) e l'intensità mediana della fluorescenza (IFM; Figura 1F) sono stati calcolati. I risultati mostrano che il trattamento IFNβ ha significativamente migliorato la percentuale di neuroni positivi per la colorazione extracellulare dell'MHCI, così come il livello di espressione, come indicato dalle IFM. L'analisi statistica e la rappresentazione grafica sono state fatte utilizzando software statistico disponibile in commercio.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61436/61436fig1v2.jpg"> Figura 1: Strategia rappresentativa di gating e quantificazione MHCI. I neuroni ippocampali primari sono stati trattati con 100 U/mL di IFNβ o solo media. Dopo 72 ore, i neuroni sono stati macchiati extracellularmente con MHCI coniugato con blu del Pacifico (1 μg / mL H2-Kb), quindi etichettati intracellularmente con NeuN coniugato in PE (diluizione 1:100). La fluorescenza cellulare è stata valutata dalla citometria del flusso e sono stati analizzati i dati. (A) Gli eventi totali sono stati tracciati come SSC-A (log) vs FSC-A (lineare) e le celle (P1) sono state gateed per escludere i detriti. (B) All'interno della popolazione P1, le cellule sono state tracciate come FSC-H (lineari) vs FSC-A (lineari) per gateare la popolazione di singole cellule. (C) All'interno della popolazione di singole celle, le celle sono state tracciate SSC-A (log) vs NeuN-PE (log). Le cellule NeuN+ sono state gated per identificare i neuroni. (D) All'interno della popolazione neuronale, le cellule sono state tracciate su un istogramma con MHCI-PacBlu sull'asse x e i numeri cellulari normalizzati in modalità sull'asse y. È stato disegnato un cancello orizzontale per quantificare la percentuale di neuroni positivi per la colorazione MHCI. (E) Quantificazione della percentuale di MHCI+ di NeuN+ cellule solo nei mezzi e neuroni trattati con IFNβ. (F) Quantificazione dell'intensità mediana di fluorescenza (IFM) di MHCI su NeuN+ cellule nei neuroni mediali (neri) e trattati con IFNβ (rosso). La significatività statistica è stata calcolata mediante test t non accoppiato. **, P < 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61436/61436fig1v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Neuron Growth Media (50 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
			<td>Concentrazione stock</td>
			<td>Per 50 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Supplemento B27</td>
			<td>2%</td>
			<td>100%</td>
			<td>1,0 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutammina</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>200 mM</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penicillina-Streptomicina</td>
			<td>100 U/ml</td>
			<td>10.000 U/ml</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mezzi neurobasali</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>48,0 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Tampone FACS (500 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
			<td>Concentrazione stock</td>
			<td>Per 500 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Siero bovino fetale</td>
			<td>2%</td>
			<td>100%</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Edta</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>500 mM</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>DPBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>489 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Soluzione di dissociazione con papaina</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
			<td>Concentrazione stock</td>
			<td>Per 1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sospensione papaina</td>
			<td>20 U/ml</td>
			<td>1000 U/ml</td>
			<td>0,020 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNasi I</td>
			<td>2,5 U/ml</td>
			<td>2500 U/ml</td>
			<td>0,001 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ibernazione-E</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1,0 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Nota: Il volume della soluzione di dissociazione della papaina necessaria varierà a seconda del numero di cervelli embrionali sezionati. Preparare 0,5 ml per cervello per i neuroni ippocampali o 1,0 ml per cervello per i neuroni corticali.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Nota: Preparare la soluzione di dissociazione vortexing sospensione di papaina in Ibernato-E per circa 3 min. Dopo che la papaina è stata completamente sciolta, aggiungere la DNasi I. Non vortice DNasi I.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Media e soluzioni.

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Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Questo protocollo descrive un metodo per coltivare i neuroni ippocampali primari dal cervello embrionale del topo. L'espressione del complesso di istocompatibilità principale di classe I sulla superficie extracellulare dei neuroni coltivati viene quindi valutata mediante analisi citometrica del flusso.

Valutazione dell'espressione del complesso di istocompatibilità maggiore classe I sui neuroni ippocampali murini primari per citometria a flusso

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A ...

assessing-expression-major-histocompatibility-complex-class-i-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

3.3K Views.  University of North Carolina at Charlotte. Questo protocollo descrive un metodo per coltivare i neuroni ippocampali primari dal cervello embrionale del topo. L'espressione del complesso di istocompatibilità principale di classe I sulla superficie extracellulare dei neuroni coltivati viene quindi valutata mediante analisi citometrica del flusso.

Video: Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolamento e analisi citofluorimetrica delle cellule immunitarie dal cervello ischemica mouse

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis of primary cultures of neurons. We describe a set of procedures for: labeling newborn mice to be genotyped, rapid genotyping, and establishing low-density cultures of brain neurons from these mice. Individual mice are labeled by tattooing, which allows for long-term identification lasting into adulthood. Genotyping by the described protocol is fast and efficient, and allows for automated extraction of nucleic acid with good reliability. This is useful under circumstances where sufficient time for conventional genotyping is not available, e.g., in mice that suffer from neonatal lethality. Primary neuronal cultures are generated at low density, which enables imaging experiments at high spatial resolution. This culture method requires the preparation of glial feeder layers prior to neuronal plating. The protocol is applied in its entirety to a mouse model of the movement disorder DYT1 dystonia (&#916;E-torsinA knock-in mice), and neuronal cultures are prepared from the hippocampus, cerebral cortex and striatum of these mice. This protocol can be applied to mice with other genetic mutations, as well as to animals of other species. Furthermore, individual components of the protocol can be used for isolated sub-projects. Thus this protocol will have wide applications, not only in neuroscience but also in other fields of biological and medical sciences.

We describe procedures for labeling and genotyping newborn mice and generating primary neuronal cultures from them. The genotyping is rapid, efficient and reliable, and allows for automated nucleic-acid extraction. This is especially useful for neonatally lethal mice and their cultures that require prior completion of genotyping.

Rapida genotipizzazione degli animali Seguito da Stabilire colture primarie di neuroni del cervello

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

Neuroscienze

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.

We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

Citometria a flusso Protocolli per superficie e intracellulare Antigen analisi di tipi di cellule neurali

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

Usando fluorescenza cellulare attivo Ordinamento per esaminare Cell-Type-specifica espressione genica nel cervello di ratto tessuto

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main macrophage populations in the CNS: (i) the microglia, which are the resident macrophages of the CNS and are derived from yolk sac progenitors during embryogenesis, and (ii) the monocyte-derived macrophages (MDM), which can infiltrate the CNS during disease and are derived from bone marrow progenitors. The roles of each macrophage subpopulation differ depending on the pathology being studied. Furthermore, there is no consensus on the histological markers or the distinguishing criteria used for these macrophage subpopulations. However, the analysis of the expression profiles of the CD11b and CD45 markers by flow cytometry allows us to distinguish the microglia (CD11b+CD45med) from the MDM (CD11b+CD45high). In this protocol, we show that the density gradient centrifugation and the flow cytometry analysis can be used to characterize these CNS macrophage subpopulations, and to study several markers of interest expressed by these cells as we recently published. Thus, this technique can further our understanding of the role of macrophages in mouse models of neurological diseases and can also be used to evaluate drug effects on these cells.

This protocol provides an analysis of the macrophage subpopulations in the adult mouse central nervous system by flow cytometry and is helpful for the study of multiple markers expressed by these cells.

Analisi dei Macrofagi Microglia e dei Monociti dal Sistema Nervoso Centrale dalla Citometria del Flusso

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of the PNS are affected by injury and disease, affecting the nerve function and the capacity for regeneration. Neuronal immune cells are commonly analyzed by immunofluorescence (IF). While IF is essential for determining the location of the immune cells in the nerve, IF is only semi-quantitative and the method is limited to the number of markers that can be analyzed simultaneously and the degree of surface expression. In this study, flow cytometry was used for quantitative analysis of leukocyte infiltration into sciatic nerves or dorsal root ganglions (DRGs) of individual mice. Single cell analysis was performed using DAPI and several proteins were analyzed simultaneously for either surface or intracellular expression. Both sciatic nerves from one mouse that were treated according to this protocol generated &#8805; 30,000 single nucleated events. The proportion of leukocytes in the sciatic nerves, determined by expression of CD45, was approximately 5% of total cell content in the sciatic nerve and approximately 5-10% in the DRG. Although this protocol focuses primarily on the immune cell population within the PNS, the flexibility of flow cytometry to measure a number of markers simultaneously means that the other cells populations present within the nerve, such as Schwann cells, pericytes, fibroblasts, and endothelial cells, can also be analyzed using this method. This method therefore provides a new means for studying systemic effects on the PNS, such as neurotoxicology and genetic models of neuropathy or in chronic diseases, such as diabetes.

Quantitative analysis of cell content within the murine sciatic nerve is difficult due to the scarcity of the tissue. This protocol describes a method for tissue digestion and preparation that provides sufficient cells for flow cytometry analysis of immune cell populations from nerves of individual mice.

Analisi delle cellule immuni in singolo nervo sciatico e del ganglio della radice dorsale da un singolo Mouse mediante citometria a flusso

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in neurological diseases including neurodegeneration and stroke. CNS-MPs are involved in phagocytic clearance of pathological proteins, debris and neuronal synapses, each with distinct underlying molecular pathways. Characterizing these phagocytic properties can provide a functional readout that compliments molecular profiling of microglia using traditional flow cytometry, transcriptomics and proteomics approaches. Phagocytic profiling of microglia has relied on microscopic visualization and in vitro cultures of mouse neonatal microglia. The former approach suffers from limited sampling while the latter approach is inherently poorly reflective of the true in vivo state of adult CNS-MPs. This paper describes optimized protocols to phenotype phagocytic properties of acutely-isolated mouse CNS-MPs by flow cytometry. CNS-MPs are acutely isolated from adult mouse brain using mechanical dissociation followed by density gradient centrifugation, incubated with fluorescent microspheres or fluorescent A&#946; fibrils, washed, and then labeled with panels of antibodies against surface markers (CD11b, CD45). Using this approach, it is possible to compare phagocytic properties of brain-resident microglia with CNS-infiltrating macrophages and then assess the effect of aging and disease pathology on these phagocytic phenotypes. This rapid method also holds potential to functionally phenotype acutely-isolated human CNS-MPs from post-mortem or surgical brain specimens. Additionally, specific mechanisms of phagocytosis by CNS-MP subsets can be investigated by inhibiting select phagocytic pathways.

Assessment of phagocytic properties of microglia and brain macrophages can provide a valuable functional dimension to molecular profiling studies. We describe a validated protocol that uses flow cytometry to rapidly and reliably quantify phagocytosis of fluorescent microspheres and amyloid beta fibrils by acutely-isolated microglia and brain macrophages from mouse models.

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central nervous system (CNS). However, further optimization of these technologies would benefit from methods allowing rapid and streamline determination of the extent of CNS and cell-specific targeting upon administration of viral vectors or nanoparticles in the body. Here, we present a protocol that takes advantage of the high throughput and multiplexing capabilities of flow cytometry to allow a straightforward quantification of different cell subtypes isolated from mouse brain or spinal cord, namely microglia/macrophages, lymphocytes, astrocytes, oligodendrocytes, neurons and endothelial cells. We apply this approach to highlight critical differences between two tissue homogenization methods in terms of cell yield, viability and composition. This could instruct the user to choose the best method depending on the cell type(s) of interest and the specific application. This method is not suited for analysis of anatomical distribution, since the tissue is homogenized to generate a single-cell suspension. However, it allows to work with viable cells and it can be combined with cell-sorting, opening the way for several applications that could expand the repertoire of tools in the hands of the neuroscientist, ranging from establishment of primary cultures derived from pure cell populations, to gene-expression analyses and biochemical or functional assays on well-defined cell subtypes in the context of neurodegenerative diseases, upon pharmacological treatment or gene therapy.

We present a flow cytometry method to identify simultaneously different cell types retrieved from mouse brain or spinal cord. This method could be exploited to isolate or characterize pure cell populations in neurodegenerative diseases or to quantify the extent of cell targeting upon in vivo administration of viral vectors or nanoparticles.

Caratterizzazione citometrica a flusso simultaneo di più tipi di cellule recuperate dal cervello del mouse/cavo spinale attraverso diversi metodi di omogeneizzazione

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

Medicina

Hippocampal Neuronal Cultures to Detect and Study New Pathogenic Antibodies Involved in Autoimmune Encephalitis

Over the last 15 years, a new category of antibody-mediated diseases of the central nervous system (CNS) has been characterized and is now defined as &#34;autoimmune encephalitis&#34; (AE). There are currently 17 known AE syndromes, and all are associated with antibodies against the neuronal cell surface or synaptic proteins. The clinical syndromes are complex and vary according to the type of associated antibody. The best-known of these diseases is anti-N-methyl D-aspartate receptor (NMDAR) encephalitis, which is a prominent neuropsychiatric disorder associated with severe memory and behavioral impairments. The associated antibodies react with the GluN1 subunit of the NMDAR at the N-terminal domain. The approach most frequently used for the discovery and characterization of AE antibodies includes the culture of dissociated, fetal, rodent hippocampal neurons. During the process of antibody characterization, live neurons in culture are exposed to patients&#39; serum or CSF, and the detection of reactivity indicates that the serum or CSF samples of the patient contain antibodies against neuronal surface antigens. Hippocampal cultures can also be used to determine whether the antibodies in patients are potentially pathogenic by examining if they cause structural or functional alterations of the neurons. The level of success of these studies depends on the quality of the cultures and on the protocols used to obtain and detect the reactivity of patient samples. This article provides an optimized protocol for primary cell culture of fetal rat hippocampal neurons combined with immunostaining to determine the presence of antibodies in the serum or CSF of patients. An example of how to examine the potential pathogenic effects of NMDAR antibodies using cultured neurons and calcium imaging is also presented.

Autoimmune encephalitis is a new category of antibody-mediated diseases of the central nervous system. Hippocampal neurons can be used to discover and characterize these antibodies. This article provides a protocol for primary cell culture and immunostaining to determine autoantibodies in the serum and cerebrospinal fluid of patients.

Colture neuronali ippocampali per rilevare e studiare nuovi anticorpi patogeni coinvolti nell'encefalite autoimmune

Over the last 15 years, a new category of antibody-mediated diseases of the central nervous system (CNS) has been characterized and is now defined as ...

Quantificazione della modifica degli istoni nel cervello di topo mediante citometria a flusso

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to histone tails. Histone post-translational modifications (HPTMs) can either facilitate gene expression or repression. For example, acetylation of histone tail lysine residues neutralizes the positive charge and reduces interactions between the tail and negatively charged DNA. The decrease in histone tail-DNA interactions results in increased accessibility of the underlying DNA, allowing for increased transcription factor access. The acetylation mark also serves as a recognition site for bromodomain-containing transcriptional activators, together resulting in enhanced gene expression. Histone marks can be dynamically regulated during cell differentiation and in response to different cellular environments and stimuli. While next-generation sequencing approaches have begun to characterize genomic locations for individual histone modifications, only one modification can be examined concurrently. Given that there are hundreds of different HPTMs, we have developed a high throughput, quantitative measure of global HPTMs that can be used to screen histone modifications prior to conducting more extensive genome sequencing approaches. This protocol describes a flow cytometry-based method to detect global HPTMs and can be conducted using cells in culture or isolated cells from in vivo tissues. We present example data from isolated mouse brain microglia to demonstrate the sensitivity of the assay to detect global shifts in HPTMs in response to a bacteria-derived immune stimulus (lipopolysaccharide). This protocol allows for the rapid and quantitative assessment of HPTMs and can be applied to any transcriptional or epigenetic regulator that can be detected by an antibody.

Autore in primo piano: Miglioramenti nella ricerca sulla regolazione dell'espressione genica

This work describes a protocol for the quantification of global histone modifications using intranuclear flow cytometry in isolated brain microglia. The work also contains the microglia isolation protocol that was used for data collection.

Quantificazione delle modificazioni post-traduzionali degli istoni globali utilizzando la citometria a flusso intranucleare nella microglia cerebrale di topo isolata

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to ...