Muchos embarazos fracasan al principio del desarrollo embrionario humano alrededor de los siete u ocho después de la fertilización. Este protocolo ofrece oportunidades a los investigadores para hacer crecer los conceptores humanos in vitro durante esta misteriosa ventana de implantación. Esto nos permite comprender los mecanismos que sustentan el éxito de la implantación humana y la formación temprana de la placenta.
El uso de un sistema de cultivo extendido para cultivar embriones humanos en estadio periimplantación in vitro es probablemente la única manera de obtener materiales auténticos para estudiar la implantación y la diferenciación temprana de trofoblastos. Esta técnica sencilla es una poderosa herramienta que nos permite responder a muchas preguntas fundamentales sobre el desarrollo temprano humano. Las investigaciones realizadas con el uso de este protocolo contribuirán en gran medida a la comprensión de la pérdida temprana del embarazo, el fracaso recurrente de la implantación y las patologías de la placenta.
Demostrando el procedimiento estará Deirdre Logsdon, el estudiante de doctorado de un laboratorio. Un día antes del calentamiento del embrión, prepare los medios y las placas de recuperación en una campana de flujo laminar estéril. Llenar dos platos de lavado de cultivo de órganos de pozo central con 500 microlitros de BM con 10%SPS, luego cubrir el BM con 500 microlitros de aceite de grado de cultivo embrionario.
En un plato de cultivo de tejido de 16 milímetros, capa ocho mililitros de aceite de cultivo embrionario y anclaje 20 microlitro gotas de BM con 10%SPS hasta la parte inferior. Equilibre los platos de lavado y la placa de recuperación en una incubadora a 37 grados Celsius, 6% dióxido de carbono y 5% oxígeno durante al menos cuatro horas. Aliquot aproximadamente cuatro mililitros de IVC 1 en un tubo de tapa de presión de cinco mililitros y preparar un plato de lavado con 500 microlitros de IVC 1 sin recubrimiento de aceite.
Equilibrar el plato y el tubo en la incubadora durante al menos cuatro horas. Diluir la fibronectina del suero humano en PBS a 30 microgramos por mililitro. Abra el paquete de cubreobjetos de ocho bien acobas teniendo cuidado de no tocar los pozos, luego pipetee suavemente 250 microlitros de la fibronectina en cada pozo.
Vuelva a colocar la tapa en el cubreobjetos e incubarlo a cuatro grados centígrados durante 20 a 24 horas. Preparar la placa de cultivo extendida en la mañana del calentamiento del embrión. Recupere el resbalón de cubierta con cámara con fibronectina y colóquelo en la campana de flujo laminar.
A continuación, retire la mezcla de fibronectina con una pipeta de un mililitro y deséchela. Pipetear 300 microlitros de la CIV 1 equilibrada en cada pozo y colocar el cubreobjetos en la incubadora hasta la eliminación de la zona pellucida. Después del calentamiento y la recuperación de los embriones humanos D5, evalúe su reaparión y tome fotografías de cada embrión.
Mueva cada embrión a 500 microlitros de un medio de manipulación con búfer MOPS con 5%FCS. Luego trátalo con la solución ácida de Tyrode como se describe en el manuscrito de texto. Mueva inmediatamente el embrión con la zona de disolución en 300 microlitros de medio con búfer MOPS calentado para apagar la solución del Tyrode.
A continuación, mueva el embrión a un plato de tejido de órgano de pozo central que contenga el BM equilibrado con 10%SPS bajo el aceite de grado de cultivo del embrión. A continuación, devuelva el embrión a la caída de recuperación de 20 microlitrotros. Mueva individualmente los embriones al plato de lavado con el medio IVC 1 equilibrado, luego mueva cuidadosamente cada embrión a un pozo del cubreobjetos con cámara, asegurándose de realizar un seguimiento de la identificación del embrión.
Devuelva el cubreobjetos con cámara a una incubadora establecida en 37 grados Celsius, 6% dióxido de carbono y oxígeno atmosférico durante dos días. En el día dos, examine cuidadosamente la fijación de los embriones bajo el microscopio e intercambie los medios. Sepa qué embrión está unido al plato tocando suavemente el plato.
Para cambiar el medio, retire la tapa y aspire cuidadosamente 150 microlitros de IVC 1, teniendo cuidado de no molestar al embrión conectado. Si un embrión aún no se ha unido a la placa, no cambie el medio porque el suero de la CIV 1 ayudará a la fijación. Pipeta lentamente 150 microlitros de medios de cultivo extendidos equilibrados, IVC 2 en cada pozo y Reemplazar la tapa en el cubreobjetos.
Devolvió cuidadosamente el cubreobjetos con cámara a la incubadora. Repita el intercambio de medios y la verificación de fijación todos los días hasta que los embriones estén listos para la fijación o la digestión de una sola célula. Si la recolección de medios gastados es necesaria para un análisis posterior, congele los 150 microlitros de IVC 1 eliminado en un tubo estéril de unión baja de 0,5 mililitros.
Lave cada embrión una vez con 200 microlitros de PBS, luego agregue 200 microlitros de solución de trippsina a cada pozo. Vuelva a colocar el cubreobjetos con cámara en la incubadora durante cinco minutos. Utilice una pipeta pequeña o una pipeta de boca finamente tirada para recoger un MTB individual y luego utilice una pipeta más grande para disociar suavemente el embrión aspirando hacia arriba y hacia abajo.
Continúe aspirando el embrión suavemente y repetidamente usando una punta de pipeta de menor diámetro hasta que el embrión haya sido incubado durante un total de 10 minutos en tripina. Para realizar la selección de una sola célula, mueva las células disociadas a través de 320 gotas de lavado de microlitros de PBS y 0.1%PVP bajo aceite de cultivo embrionario, teniendo cuidado de no perder ninguna célula. Después de lavar las células utilice una pipeta de vidrio finamente tirada para seleccionar una celda.
Pipetee cuidadosamente la célula única en un tubo de unión bajo estéril de 0,2 mililitros con un volumen mínimo de PBS y PVP. Enganche las células individuales libres en nitrógeno líquido y guárdelas en 80 grados Celsius negativos para su uso posterior. Los embriones sanos mostraron proliferación continua a lo largo del cultivo prolongado, mientras que los embriones anormales comenzaron a retraerse de sus bordes exteriores y desintegrarse.
En el día ocho después de la fertilización, la mayoría de las células en los embriones eran citotrofobia o CTB, que eran positivas para el marcador de trofoblasto GATA-3. En la periferia del embrión, los CTB ya estaban diferenciando en sindiscotiostiotrofoblastos multinólidos, que tenían una hoja como apariencia y teñido positivo para los seres humanos CGB. En el día 10, la formación de células de trofoblasto migratorios positivas de CGB estaba en un máximo, lo que fue confirmado por el aumento de la producción de HCG en este momento.
Los trofoblastos migratorios que manchan positivos para el HLA-G, también comenzaron a emerger y migrar lejos del cuerpo embrionario. Para el día 12, la diferenciación de STB estaba en declive y la producción de MTB se hizo más prominente, lo que sugiere un cambio de énfasis de la producción de hormonas en el día 10 a la migración celular el día 12. Estos cambios se pueden observar en un vídeo de lapso de tiempo del período periimplantación.
El video muestra el colapso del blastocele, la formación del STB, y la eventual diferenciación y migración de MTB. Lo más importante a tener en cuenta al completar este procedimiento es que está trabajando con embriones vivos que son sensibles a los cambios de temperatura, osmolalidad y pH. Minimizar la cantidad de tiempo que los platos están fuera de la incubadora es fundamental para mantener la salud embrionaria.
Después de completar este procedimiento, los investigadores pueden utilizar células individuales aisladas para ensayos de omica de células individuales aguas abajo, como la secuenciación de ARN de células simples y la secuenciación de bisulfito del genoma completo para comprender mejor los cambios epigenéticos y transcriptómicos durante la implantación humana y la formación temprana de placenta.
