Estos métodos se pueden utilizar para determinar los factores que influyen en la invasión de trofoblastos que pueden proporcionar una visión de los principales resultados obstétricos adversos. La ventaja de esta técnica es que proporciona un análisis visual y cuantitativo de varios factores que pueden influir en la invasión de trofoblastos incluyendo la proliferación y la migración. Para comenzar el ensayo de rasguño, sembrar el número adecuado de células en una placa de 24 pozos para lograr una confluencia del 100% en 48 horas.
Al día siguiente, cambie los medios a medios libres de rojo fenol complementados con carbón termoactivado dextrano despojado FBS. El día del rasguño, agregue el tratamiento deseado al medio en cada pozo para pretratar las células durante 30 minutos. Para crear heridas uniformes, coloque las puntas estériles de una pipeta de 10 microlitros en los pasadores de la herramienta fabricante de heridas.
Baje las puntas en la primera fila de pozos y mueva la placa a lo largo de la pista del fabricante de heridas hasta que las puntas de la pipeta lleguen al otro lado del pozo. A continuación, vuelva a mover la placa a la posición inicial para asegurar una herida constante a lo largo del diámetro del pozo. Baje las puntas en la siguiente fila de pozos y repita hasta que todos los pozos estén rayados.
Confirme que el rasguño cubre el ancho del pozo observando la placa bajo un microscopio. A continuación, aspirar cuidadosamente los medios y lavar suavemente las células con 1x PBS dos veces. Después de un lavado final, añadir fenol rojo suplementario despojado o bajo medio FBS con un tratamiento deseado.
A continuación, coloque la placa con los pozos rayados en un cámara de tiempo automatizado alojado en una incubadora que contiene 37 grados Celsius de temperatura y 5% dióxido de carbono a una atmósfera de 95% de humedad. Ime la imagen de las células a intervalos regulares según sea necesario para permitir que las células completen la cicatrización de heridas. Para comenzar el ensayo de invasión, siembra el número adecuado de células en placas de seis pozos en una incubadora que mantiene 37 grados Celsius de temperatura y 5% de dióxido de carbono a una atmósfera de 95% de humedad.
Permita que las células alcancen el 90% de confluencia en 48 horas. Al día siguiente, cambie los medios a medios libres de rojo fenol complementados con carbón termoactivado dextrano despojado FBS. Coloque un vial de 10 miligramos por matriz extracelular mililitro en un refrigerador sobre hielo y deje que se descongele durante la noche.
Al día siguiente, utilice puntas de pipeta refrigeradas para diluir 10 miligramos por mililitro de la matriz extracelular con los medios libres de suero libre de rojo fenol a una concentración final de cinco miligramos por mililitro. A continuación, añada 100 mililitros de la matriz extracelular diluida a las plaquitas refrigeradas que se han colocado en la placa refrigerada de 24 pozos. Incubar la placa a 37 grados Celsius para permitir que la matriz se endurezca.
Para preparar las células para el ensayo de invasión, lave las células con un mililitro de 1x PBS. A continuación, aspirar el PBS y añadir 500 microlitros de 1x Trypsin EDTA a cada pozo. Coloque la placa de seis pozos en la incubadora que mantiene 37 grados Celsius de temperatura y 5% de dióxido de carbono en una atmósfera de 95% de humedad hasta que todas las células se hayan separado de la parte inferior de la placa.
Una vez que las células se hayan desprendido, agregue 500 microlitros de los medios libres de suero libre de rojo fenol a cada pozo de las células tripinsadas. Luego transfiera 1.000 microlitros de células separadas a un tubo de microcentrífuga y gire hacia abajo durante cinco minutos a 400 veces g a cuatro grados centígrados. A continuación, aspirar los medios y resuspender las células en los medios libres de suero libre de rojo fenol.
Cuente las células utilizando un contador de células automatizado y ajuste el volumen de la suspensión celular para una concentración final de 0,5 millones de células por mililitro. Agregue 600 microlitros de los medios de crecimiento completos a cada pozo de la placa de 24 pozos y coloque el inserto pre-recubierto en él. Luego agregue 200 microlitros de células encima de cada inserto de celda pre-recubierto para un total de 0,1 millones de células.
Coloque la placa de 24 pozos en la incubadora que mantiene 37 grados celsius de temperatura y 5% de dióxido de carbono en una atmósfera de 95% de humedad durante 24 horas. Después de la incubación durante la noche, succionar los medios restantes de las cámaras superior e inferior sin alterar la matriz extracelular. Luego retire cuidadosamente la matriz extracelular y las células no invadidas de la parte superior de las inserciones con un hisopo de algodón.
Lave cada plaquita tres veces añadiendo 1x PBS a las cámaras superior e inferior del pozo. Aspirar PBS después de cada lavado. Para fijar las células unidas a las plaquitas, coloque las plaquitas en metanol 100% frío en cuatro grados Celsius durante 30 minutos.
Lave las plaquitas tres veces con 1x PBS y retire PBS después del lavado final. Mancha las celdas unidas a las inserciones con 0.2% de cristal violeta en 20%etanol durante 10 minutos. Enjuagar con agua desionizada tres veces y aspirar agua desionizada después del lavado final.
Secar al aire las plaquitas a temperatura ambiente durante una hora. Finalmente usando fórceps y una cuchilla de afeitar, corte cuidadosamente la membrana inferior de la plaquita y móntela en un portaobjetos de vidrio con la parte inferior hacia arriba. Usando un microscopio de luz con un objetivo 20X, obtenga al menos cuatro imágenes únicas de las células invadidas por muestra.
Para comenzar el ensayo de proliferación, utilice un contador de células automatizado para contar las células trippsinizadas desde el matraz. Células de semillas en placas de seis pozos a una densidad de 0,2 millones de células por pozo en medios de crecimiento estándar. A continuación, coloque las células en la incubadora que mantiene 37 grados Celsius de temperatura y 5%dióxido de carbono en la atmósfera de 95% de humedad durante cuatro horas o hasta que las células se hayan adherido.
A continuación, cambie los medios a medios libres de rojo fenol complementados con dextrano dextrano de carbón inactivado por calor y el tratamiento deseado. Coloque la placa de seis pozos en la incubadora que mantiene 37 grados Celsius de temperatura y 5% de dióxido de carbono en una atmósfera de 95% de humedad. A continuación, reemplace el medio con los medios frescos complementados con el tratamiento deseado cada 48 horas.
Después de 24, 48 o 72 horas de tratamiento, lave las células con un mililitro de 1x PBS y agregue 500 microlitros de Trypsin EDTA a cada pozo. Coloque una placa de seis pozos en la incubadora hasta que las células se hayan separado de la placa. Una vez que las células se han separado de la placa, añadir 500 microlitros de los medios libres de rojo fenol suplementado para desactivar la tripsina.
Finalmente añadir cinco microlitros de las células trippsinizadas a cinco microlitros de Trypan Blue en un tubo separado y mezclar por pipeteo. Utilice un contador de celdas automatizado para contar las celdas de cada pozo en duplicado. Inmortalizado humano primer trimestre trofoblasto Cisne.
71 células fueron tratadas durante cero, ocho y 18 horas con el vehículo 1x PBS o 100 micromolares de la dexametasona glucocorticoides sintéticas en el ensayo de arañazos. Medición del tamaño de la herida y la densidad de la herida en Swan. 71 y las células HTR-8/SVneo tratadas con vehículo o 100 dex nanomolares mostraron que el tratamiento con dexescieron reducido la tasa de cierre de la herida, lo que indicaba que los glucocorticoides podían inhibir la migración celular.
Después del ensayo de invasión, el tratamiento con glucocorticoides redujo la invasividad celular, como lo demuestra una reducción del 15% en el número de cisnes invadidos. 71 y células HTR-8/SVneo tratadas con 100 dex nanomolares durante 24 horas en comparación con las células tratadas con vehículo. Después del ensayo de proliferación celular, el tratamiento con glucocorticoides redujo la proliferación celular según lo indicado por menos Cisne.
71 y células HTR-8/SVneo tratadas con 100 dex nanomolares en comparación con las células tratadas con vehículo. Los métodos para evaluar la muerte celular podrían utilizarse junto con este procedimiento para determinar si la apoptosis o la necrosis contribuyen a las funciones alteradas del trofoblasto. Hemos adoptado de forma única el uso de técnicas estándar utilizadas rutinariamente en la biología del cáncer para el estudio de la función trofoblasta.
No hay peligros asociados con estos métodos. La única precaución que los espectadores deben tomar es el uso de una técnica estéril para el cultivo de tejidos.
