Este es un protocolo de video para el método de interferencia de ARN mediado por electroporación en Odonata. Las libélulas y las damiselas, miembros de la orden Odonata, se encuentran entre los insectos más ancestrales. Los adultos Odonata muestran una notable diversidad en los colores y patrones del cuerpo, y se han realizado muchos estudios ecológicos y conductuales.
Sin embargo, se han faltado estudios genéticos moleculares sobre Odonata, porque el análisis funcional géne genético es muy difícil. Por ejemplo, el método RNAi convencional no es eficaz en las especies de Odonata. Recientemente, establecimos un método RNM en combinación con la electroporación in vivo.
Aquí, proporcionamos un protocolo de video para el RNAi mediado por electroporación tanto en libélulas como en damiselas. Como nuestras especies representativas de damiselas, usamos la presa de cola azul. Ischnura senegalensis.
Esta es una de las especies más comunes de damselfly y a menudo se encuentra en estanques soleados en Japón. En primer lugar, mostramos el protocolo RNAi apuntando al abdomen de una presa, Ischnura senegalensis. Después de la anestesia helada en esos dos pines a ambos lados del protórax y fijar la larva a un soporte fijo.
Tire y estire la membrana interseglírica entre el séptimo y octavo segmento abdominal utilizando fórceps. Mantenga la membrana intersegrada estirada a mano. Inserte la punta del capilar preparado en la membrana intersegmental estirada.
Inyecte 1 microlitro de siRNA o solución de dsRNA. Aplicar dos gotas de gel de ultrasonido en la superficie larvaria utilizando fórceps. Coloque los electrodos en el gel de ultrasonido, con el electrodo positivo en el lado de la inyección.
Generar 10 veces pulsos de electroporación usando un electroporador. Limpie el gel restante en la superficie con una toalla de papel. Retire los alfileres de insectos y mantenga las larvas tratadas en una toalla de papel húmeda durante aproximadamente un día para su recuperación.
A continuación, mostramos el protocolo RNAi apuntando al tórax de una presa, Ischnura senegalensis. Después de la anestesia helada, adjunte dos pines a ambos lados del protórax y fije la larva a un soporte fijo. Tire y estire la membrana intersegmental entre el protórax y el sintetizador con la mano.
Inserte la punta del capilar preparado en la membrana intersegmental estirada. Inyecte un microlitro de siRNA o solución de dsRNA. Aplicar dos gotas de gel de ultrasonido en la superficie de la larva usando fórceps.
Coloque electrodos en el gel de ultrasonido, con un electrodo positivo en el lado de la inyección. Generar 10 veces pulsos de electroporación utilizando un electroprolador. Limpie el gel restante en la superficie con una toalla de papel.
Retire los alfileres de insectos y mantenga las larvas tratadas en una toalla de papel húmeda durante aproximadamente un día para su recuperación. Como especie representativa de libélula utilizamos la libélula Pied skimmer. Pseudothemis zonata.
Esta es una de las especies de libélula más comunes y a menudo se encuentra en estanques sombríos en Japón. Finalmente, mostramos el protocolo RNI apuntando al abdomen de una libélula, Pseudothemis zonata. Estirar la membrana intersegmental entre el cuarto y quinto segmento abdominal.
Haga un pequeño agujero con una aguja fina entre el cuarto y el quinto segmento abdominal. Inserte la punta del capilar preparado en el orificio preparado. Inyecte un microlitro de siRNA o solución de dsRNA.
Fije la larva a un soporte fijo usando alfileres. Aplicar dos gotas de gel de ultrasonido en la superficie larvaria utilizando fórceps. Coloque electrodos en el gel de ultrasonido con el electrodo positivo en el lado de la inyección.
Generar 10 veces pulsos de electroporación usando un electroporador. Limpie el gel restante en la superficie con una toalla de papel. Retire los alfileres de insectos y mantenga las larvas tratadas en una toalla de papel húmeda durante aproximadamente un día para su recuperación.
Aquí seleccionamos un gen de síntesis de melanina MCO2 como el gen objetivo, y EGFP o bla como objetivo de control negativo. MCO2 es esencial para la formación de color negro en varios insectos. Primero mostramos los resultados en el abdomen de Ischnura senegalensis.
Las puntas de flecha blancas indican las regiones de pigmentación negra suprimida donde el electrodo positivo se colocó sobre la electroporación. Se observó la incubación de pigmentación tanto mediante el tratamiento con siRNA como por el tratamiento con ARDS. El tamaño y la ubicación del fenotipo RNI variaron considerablemente entre los individuos.
Sin electroporación no se observaron fenotipos RNI, lo que indica que la electroporación es esencial para RNI en esta especie. A continuación, mostramos los resultados en el tórax de Ischnura senegalensis. Del mismo modo, se observó inhibición de la pigmentación negra en toda la región donde se colocó el electrodo positivo sobre la electroporación.
Finalmente, mostramos los resultados en el abdomen de Pseudothemis zonata. Como era de esperar, el fenotipo RNI se detectó alrededor de la región donde se colocó el electrodo positivo sobre la electroporación. Confirmamos que el método RNAi mediado por electroproración es muy útil en Odonata.
Puede inducir la supresión del gen local casi 100% eficiencia. Al menos en la epidermis, cuando seleccionamos etapas de desarrollo apropiadas. Este método tiene varios sobre el método CRISPR/Cas9.
Por ejemplo, la región donde aparecen los fenotipos de ARNi puede controlarse mediante la posición del electrodo positivo tras la electrporación, y los fenotipos de ARN se pueden comparar fácilmente con los fenotipos de control uno al lado del otro en el mismo individuo. Además, este método no requiere microinyección en huevos diminutos. Así que es mucho más fácil y rápido observar el fenotipo más rápido que el método CRISPR/Cas9.
Además, este método se puede aplicar a insectos cuyos huevos recién puestos son difíciles de recoger. Por ejemplo, las hembras de Pseudothemis zonata ponen huevos durante el vuelo. Así que es muy difícil recoger sus huevos recién puestos.
Esperamos que este protocolo pueda ser generalmente aplicable a los organismos no modelo cuando el RNI convencional no funciona de manera eficiente.
