Anche se l'editing genico è diventato popolare per lo studio della genetica molecolare di organismi non modello, RNAi rimane un potente strumento sinergico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere applicata a diverse fasi di sviluppo. Inoltre, il knockdown parziale può essere usato per studiare questi interi geni.
Il successo della procedura si basa sull'iniezione di DSR e ha un danno minimo. Questo richiede pratica, quindi non scoraggiarti se ci vogliono alcuni tentativi per farlo bene. Per preparare embrioni allo stadio iniziale per la micro iniezione, versare prima l'ebollizione del 20% di agarosio in una piccola piastra di Petri e posizionare tre tubi di plastica larghi da uno a due millimetri sulla superficie dell'agarosio liquido prima che si solidifichi.
Una volta che l'agarosio si è solidificato utilizzare un paio di forcette smussate per rimuovere i tubi e coprire le rientranze risultanti con 500 microlitri di acqua distillata in autoclave. Quando il contenitore di raccolta è pronto, utilizzare una spazzola per capelli naturale fine per trasferire cinque embrioni T.marmoratus vecchi di otto ore dai siti di nidificazione dello scarabeo in un piatto di cavità di vetro pieno di acqua distillata in autoclave al microscopio stereo. Usando il microscopio e le forcelle di dissezione fine afferrano il corione di ogni embrione da entrambi i lati e strappano il corone aperto permettendo all'embrione di scivolare delicatamente fuori dal tessuto.
Dopo aver rimosso entrambi gli strati di corione da tutti gli embrioni raccolti, utilizzare il pennello per trasferire accuratamente gli embrioni dal piatto della cavità del vetro nelle scanalature della piastra di agarosio preparata. Per iniettare embrioni allo stadio iniziale con RNA a doppio filamento specifico del gene, preparare prima gli aghi di microiniezione su una puler dell'ago e utilizzare il microscopio stereo e trovare pini per rompere ogni punta su un bordo affilato. Dopo aver gettato l'RNA a doppio filamento purificato di interesse sul ghiaccio, aggiungere un microlitro di tampone di iniezione 10X alla soluzione risultante e utilizzare acqua distillata doppia per portare il volume in vinile della soluzione a 10 microlitri.
Utilizzare una pipetta P10 per riempire uno degli aghi di microiniezione preparati con la soluzione di RNA a doppio filamento funzionante e caricare l'ago in un supporto per microneedle collegato a un sistema di microiniezione che utilizza la tecnologia di espulsione della pressione. Accendere il sistema di microiniezione e l'alimentazione dell'aria pressurizzata e utilizzare la micro valvola sul sistema di microiniezione per impostare la pressione di iniezione su 15 libbre di pressione per pollice quadrato, quindi utilizzare la manopola di regolazione del tempo per impostare la durata dell'iniezione su secondi. Per calibrare l'ago di iniezione valutare il volume della bolla di fluido che si forma sulla punta dell'ago quando si inietta in aria per l'embrione T.marmoratus utilizzare una dimensione ottimale della bolla da 100 a 200 micron.
L'ago di iniezione è di buona qualità se è possibile ottenere bolle ottimali a 15 libbre di pressione per pollice quadrato con una durata di iniezione di circa tre secondi. Quando l'ago impostato è pronto allineare l'ago sulla piastra di agarosio degli embrioni in modo tale che l'ago si avvicini agli embrioni con un angolo da 45 a 60 gradi. Utilizzare il micro manipolatore per spostare lentamente il microneedle fino a quando la punta non tocca la superficie del centro di un embrione, quindi spostare attentamente l'ago in avanti fino a quando non perfora solo la superficie dell'embrione.
Una volta che l'ago è all'interno dell'embrione premere attentamente il pulsante di iniezione del micro iniettore per fornire uno o due nanolitri di RNA a doppio filamento nell'embrione. Quando tutto l'RNA è stato consegnato, ritrarre lentamente l'ago dall'embrione senza causare la rottura dell'embrione. Gli embrioni iniettati con successo possono essere identificati dalla presenza di una macchia colorata nel sito di iniezione.
Quando tutti gli embrioni sono stati iniettati con cura, posizionare il piatto in una camera di umidità in un'incubatrice di 25 gradi Celsius impostata su un ciclo buio di 14 ore e 10 ore per quattro o cinque giorni. Monitora quotidianamente i progressi dello sviluppo dell'embrione al microscopio stereo per identificare fenotipi di knockdown morfologicamente visibili. Utilizzo di una fotocamera digitale ad alta risoluzione per documentare il processo di sviluppo.
Rimuovere ogni giorno eventuali embrioni morti e reintegrare l'acqua sulla piastra di agarosio per evitare l'essiccazione e la diffusione della contaminazione microbica ad altri embrioni sopravvissuti durante il periodo di incubazione. Prima di raccogliere la larva aggiungere prima da 60 a 70 gradi Celsius 2%agarosio liquido a una piccola piastra di Petri. Quando l'agarosio si è solidificato, utilizzare forcep smussate per fare un gruppo poco profondo per larva da iniettare nell'agarosio e drenare delicatamente l'acqua dalle tazze di coltura della larva.
Dopo l'anestesia utilizzare morbide forceli terminate per posizionare con cura la larva sulla piastra di immobilizzazione con i colli e i corpi nelle scanalature ma la coda situata sopra la superficie dell'agarosio. Quando tutta la larva era stata posizionata, coprire ogni lava con uno spesso strato di agarosio che è ancora liquido ma non pericolosamente caldo e liberare eventuali racconti che sono stati accidentalmente coperti se necessario. per un carico di microiniezione di RNA a doppio filamento un microneedle con la soluzione di lavoro dell'RNA a doppio filamento specifica genica di interesse, come dimostrato.
Redrag lo stantuffo di una siringa di microiniezione controllata manualmente e caricare l'ago sul sistema di microiniezione. Posizionare la larva immobilizzata al microscopio stereo in modo che il sito di iniezione sia allineato con la traiettoria dell'ago di microiniezione con un angolo relativamente piatto. Utilizzare il micro manipolatore per spostare attentamente la punta dell'ago nella larva e applicare lentamente e attentamente la pressione sulla siringa, regolando la pressione di iniezione in base al movimento del fluido di iniezione colorato nell'ago, se necessario.
Quando tutto l'RNA è stato iniettato, utilizzare forcep morbide per liberare la larva dall'agarosio e posizionare la larva in un nuovo contenitore di acqua a temperatura ambiente a 25-28 gradi Celsius e un ciclo buio di 14 ore leggero di 10 ore. In questa analisi rappresentativa tre diversi geni sono stati abbattuti in una varietà di diverse fasi di sviluppo dello scarabeo subacqueo T.marmoratus. L'interferenza dell'RNA viene eseguita come dimostrato iniettando RNA a doppio filamento in una fase molto precoce dell'embriogenesi.
Alcuni degli embrioni non sopravvivono al processo e diventano necrotici. In queste immagini controllano l'individuo e si può osservare un individuo con un colore degli occhi leggermente più chiaro. In questo individuo, un knockdown più grave in cui le bugie più ventrali dell'ammasso sono completamente non ottimizzate, ma gli alleati do mostrano ancora una certa pigmentazione può essere osservata.
Qui viene mostrato un esempio di un altro individuo con perdita di pigmento essenzialmente completa in tutti gli occhi. Lac2 abbattuto nelle larve si traduce in una cuticola meno pigmentata, sono stati ottenuti anche individui adulti più leggeri con ali un po 'deformate probabilmente a causa dell'insolita morbidezza del tessuto. Assicurati di guardare con attenzione per osservare da vicino i tuoi animali iniettati su base giornaliera e rimuovere immediatamente eventuali individui morti.
Il potere di questa tecnica è che può essere applicato ai geni di molti organismi diversi. Questa tecnica è stata anche ampiamente e con successo applicata alla biologia evolutiva dello sviluppo.
