Los autores desean agradecer el apoyo por el &quot;Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette&quot; para la cría de animales. Este trabajo fue apoyado por fondos de la ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 y ANR-11-JSV2-002-01) a Michael Schubert, por la subvención de la Unión Europea 6PM &quot;Embryomics&quot; y por la subvención ANR &quot;ANR- 10-BLAN-121801 Dev-Proceso &quot;de Jean-François Nicolas y Nadine Peyrieras. João Emanuel Carvalho es financiado por una beca de doctorado FCT (SFRH / BD / 86878/2012). Las solicitudes de los vectores descritos aquí pueden dirigirse directamente a los autores.

1. Elaboración de Instrumentos y Reactivos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Traslado pipetas Pasteur <ol><li> Generar una serie de pipetas Pasteur de transferencia con diferentes diámetros de punta tirando de 230 mm de largo pipetas Pasteur por encima de una llama a diferentes velocidades. Asegúrese de que la conicidad es tan larga como sea posible para un control suave y fino de la aspiración. </li><li> Con una punta trazadora de diamante, rayar la pipeta a lo largo de una línea perpendicular a la longitud de la pipeta. Con las dos manos, tire de la pipeta en paralelo a su longitud para generar un corte romo. Rápidamente llama a pulir la pipeta sin sellar la punta. </li><li> Variar el diámetro de la punta con la etapa de los ovocitos / embriones que se debe verter: 300-400 micras de ovocitos no fecundados (alrededor de 150 micras de diámetro), a 600 m para los huevos fertilizados (alrededor de 500 micras de diámetro), 200-400 micras para neurulae rayada. Utilizar pipetas con un tubo de aspiración boca supervisado para transferir los ovocitos / embriones de un platoa otro. </li></ol></li><li> Agujas de inyección <ol><li> Manipular los capilares con guantes para garantizar condiciones RNasa libre. Utilice vidrio borosilicato con capilares de filamentos con dimensiones de 1,20 mm OD, ID 0,94 mm, longitud 10 mm. </li><li> Si capilares se tiran en el tipo de calentamiento de filamentos aguja extractor descrito en la Lista de materiales, utilice los siguientes ajustes: Heat 600, Pull 50, Velocidad 80, Hora 60, presión 200 o 300. De lo contrario, asegúrese de que la forma, que es crucial para inyecciones exitosas, es como se muestra en la Figura 2 con las siguientes propiedades: 4-8 m de diámetro exterior de la punta, 2 cm de longitud de forma cónica. NOTA: Las agujas se puede tirar antes de la temporada de desove y se utiliza durante toda la temporada. </li></ol></li><li> Solución de rojo fenol almacén 5% (4x) <ol><li> Preparar fresca antes de cada temporada de desove. </li><li> En un tubo de micras de filtración de 0,22, pesar 25 mg de polvo rojo fenol. </li><li> Añadir 0,5 ml de DNasa y RNasa libre de agua parael tubo que contiene el polvo. </li><li> Girando durante 3-5 min a 18.000 xg a temperatura ambiente para filtrar esterilizar la solución y eliminar cristales que puedan obstruir la aguja de inyección. </li><li> Almacenar a 4 ° C o almacenar 250 ml de alícuotas a -20 ° C. </li></ol></li><li> 0,25 mg solución de poli lisina / ml <ol><li> Preparar fresca antes de cada temporada de desove. </li><li> Disolver 5 mg de poli-L-lisina en 20 ml de agua destilada. Tienda alícuotas de 5 ml a -20 ° C. </li><li> Utilice una alícuota descongelada inmediatamente y sólo una vez para asegurar la adhesión reproducible y robusto de los ovocitos a el plato de poli-lisina. </li></ol></li><li> la síntesis de ARNm <ol><li> Preparar fresca antes de cada temporada de desove. </li><li> Linealizar 5 g de ADN de interés con la enzima adecuada (por lo general de 2 horas, a 37 ° C). Para verificar la integridad de la digestión, ejecute un 2% en volumen de la mezcla de digestión en un gel de agarosa-TBE 1% en tampón TBE a 150 W durante 20 minutos. </li><li> Se extrae la lineaADN AUTORIZADO con 25: 24: 1 de fenol (pH 8,0): cloroformo: alcohol isoamílico. Vortex durante 20 segundos, se centrifuga 10 min a 18.000 xg y recoger la fase acuosa (superior). </li><li> Se extrae la fase acuosa de nuevo con 24: 1 de cloroformo: alcohol isoamílico. Vortex durante 20 segundos, centrifugar 10 min a 18.000 xg y recoger la fase acuosa. </li><li> Precipitar el ADN linealizado con 100: 10: 300 DNA linealizado: acetato de sodio 3 M (pH 5,2): 100% de etanol durante la noche a -20 ° C. </li><li> Centrifugar 20 minutos a 18.000 xg a 4 ° C. Enjuague en etanol al 70%. </li><li> Centrifugar 10 minutos a 18.000 xga 4 ° C. Deje secar y volver a suspender en agua libre de RNasa a una concentración final de 0,5 mg / l. </li><li> Transcribir 1 g de ADN linealizado utilizando un kit de síntesis de ARNm con la polimerasa apropiada, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Extraer el ARNm con 5: 1 de fenol (pH 4,7): solución de parada cloroformo y acetato de amonio proporcionado con el kit. </li><li> Vortex durante 20 segundos, centrifuge 10 min a 18.000 xg y recoger la fase acuosa. </li><li> Se extrae la fase acuosa de nuevo con 24: 1 de cloroformo: alcohol isoamílico. Vortex durante 20 segundos, centrifugar 10 min a 18.000 xg y recoger la fase acuosa. </li><li> Precipitar el ARNm con 100% de isopropanol durante la noche a -20 ° C. </li><li> Centrifugar 20 minutos a 18.000 xg a 4 ° C. Enjuague con etanol al 80%. </li><li> Centrifugar 10 minutos a 18.000 xga 4 ° C. Deje que el sedimento seco a temperatura ambiente durante no más de 5 a 10 minutos, ya que entonces será difícil para volver a suspender. Resuspender en DNasa y RNasa libre de agua a una concentración final de al menos 2 g / l para asegurar una concentración final de mRNA decente en la mezcla de inyección. </li><li> Para comprobar la calidad y el tamaño del producto de transcripción, ejecute 0,5 l de la ARNm en un 1% de gel de agarosa-TBE RNasa libre en tampón TBE a 150 W durante 20 min. Tienda 2 alícuotas a -80 ° C. </li></ol></li><li> Platos poli-lisina NOTA: Poli-lisina coaplatos TED se utilizan para inmovilizar los ovocitos durante la inyección. <ol><li> Para cada 35 mm de cultivo celular placa de Petri (5 en total), cubrir la parte inferior de la placa de Petri con 1 ml de la solución de poli-lisina descongelado 0,25 mg / ml. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Por cada 35 mm de cultivo celular placa de Petri (5 en total), transferir la solución de poli-lisina 0,25 mg / ml en otro 35 mm de cultivo celular placa de Petri. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Deseche la solución de poli-lisina 0,25 mg / ml. </li><li> Deje que los platos de Petri seca, boca abajo a temperatura ambiente durante 2 hr. </li><li> Guarde los platos poli-lisina recubierto envueltas en una envoltura de plástico a 4 ° C para evitar la contaminación durante una semana como máximo. </li></ol></li><li> Platos de agarosa recubiertas de NOTA: Se utilizan para la cultura inyectado embriones. La agarosa proporciona un cojín para los embriones inyectados y evita que se pegue al fondo del plato. <ol><li> Hacer agua de mar artificial (ASW), utilizando 37 a 38 g / L commsales erciales + 0,25 mM NaHCO3 en agua de ósmosis inversa. </li><li> Disolver agarosa a una concentración del 1% en 0,22 micras ASW filtrada por calentamiento de la solución en un microondas. </li><li> Rápidamente se vierte la solución de agarosa caliente de una placa de Petri de 35 mm en otro a fin de garantizar un recubrimiento de agarosa muy delgada del plato. </li><li> Almacenar los platos de agarosa recubiertas de envueltos en Saran Wrap a 4 ° C para evitar la contaminación durante una semana como máximo. </li></ol></li><li> Mezcla de inyección y la carga de las agujas de inyección <ol><li> Acerca de 2 hr antes de comenzar las inyecciones, hacer una mezcla de inyección de 2 l en RNasa y agua libre de DNasa con concentraciones finales de 1-1,8 g / l de ARNm, 15% de glicerol, 1,25% de rojo fenol. NOTA: Los colores rojo fenol La solución, que permite el seguimiento de la eficacia de la inyección y la identificación de los embriones inyectados con éxito. El glicerol favorece la difusión de ARNm dentro del ovocito. </li><li> Centrifugar 4 min a 18.000 xg acristales de pellets. Mantener en hielo hasta su uso. </li><li> Con una pipeta de 10 l, recoger 0,5 l de la mezcla de inyección, evitando la parte inferior del tubo, donde se han sedimentado los cristales. </li><li> Rellene al menos dos agujas de inyección (en caso de que se rompe durante la inyección) pipeteando la caída de 0.5 l de la mezcla de inyección en la abertura grande de la aguja. </li><li> Instalar las agujas en un frasco de almacenamiento de líquido en la parte inferior a 4 ° C para evitar la evaporación de la mezcla de inyección. Deje que la mezcla de inyección lentamente viajar a la punta de la aguja de inyección durante al menos 1 hr para reducir al mínimo la creación de burbujas. </li><li> Tienda mezcla adicional de inyección a -80 ° C para un máximo de tres usos adicionales, después de lo cual se deteriora la calidad de ARNm (datos no mostrados). </li></ol></li></ol> 2. Recolección de material biológico, microinyección y cultivo de embriones <ol style="margin-left: 40px;"><li> Ovocitos y espermatozoides colección NOTA: Ver Theodosiouet al., 12 para un protocolo detallado para inducir el desove, y de recogida de gametos. <ol><li> Machos y hembras de Choque en ASW a 23 ° C durante 24 horas. </li><li> De una a dos horas antes de la puesta del sol, transferir los adultos en copas individuales en ASW a 19 ° C, ya que la mayoría de los adultos desovan 1-2 horas después de la puesta del sol. </li><li> Enjuague 35 mm placas de Petri en ASW se filtró y dejar secar al revés para evitar que los ovocitos se pegue a la parte inferior del plato. </li><li> Tras el desove, recoger inmediatamente los espermatozoides y ovocitos con una pipeta 1.000 l. <ol><li> Mantener esperma y ovocitos separada de amphioxus adulto porque el contacto es perjudicial para la salud de gametos (datos no mostrados). </li><li> Además, evitar asustar a los adultos, lo que conduce a movimientos que disipan, y por lo tanto diluir, tanto esperma y ovocitos. Para mantener el esperma activo el mayor tiempo posible y para optimizar la tasa de fertilización, recoger el esperma lo más concentrada posible. </li></ol></li><li> Manteneresperma en hielo en un tubo de 1,5 ml. </li><li> Traslado ovocitos en filtrada ASW en los 35 mm platos pre-enjuagado Petri. </li><li> Transferencia 100-500 ovocitos con una anterioridad tirado 300-400 micras transferencia pipeta Pasteur a otro de 35 mm placa de Petri para realizar las inyecciones. </li><li> Fertilizar el resto del embrague como un control para el esperma y calidad de los ovocitos o para otros experimentos. </li></ol></li><li> Inyección de ovocitos <ol><li> Instalar la aguja de inyección en el micromanipulador en un 50 ° ángulo con respecto al plano horizontal. NOTA: Los ángulos de menos de 50 ° empujarán los ovocitos alrededor en el plato, mientras que los ángulos de más de 50 ° no permitirán un adecuado seguimiento de la posición de la aguja en relación con el ovocito. </li><li> Bajo un microscopio de disección fluorescente con 25X oculares, transferir 30 ovocitos con el 300-400 micras transferencia pipeta Pasteur en un plato de poli-lisina que contiene filtrada ASW. </li><li> Deposite los ovocitos largo de una línea para llevarinyecciones a cabo de manera ordenada y distinguir inyectados de oocitos no inyectados. Inyectar pequeños números (30 oocitos) para minimizar el tiempo de exposición de ovocitos a la poli-lisina, que tiende a deformar los embriones en desarrollo (datos no mostrados). </li><li> Use la iluminación de campo oscuro para hacer que los ovocitos como translúcido posible. </li><li> Con el mando de movimiento grosero del micromanipulador, llevar la aguja de inyección de cerca de un ovocito. </li><li> Con unas pinzas finas, cortar y abrir la aguja en el nivel donde la punta comienza a ser curvado. Por pulsante con el inyector, compruebe que la mezcla de inyección de tinta está fluyendo en realidad fuera de la aguja. </li><li> En una ampliación de 200X y con el mando de movimiento fino del micromanipulador, mover suavemente la aguja de inyección dentro del núcleo del ovocito. NOTA: Si se inserta demasiado superficial, la solución inyectada no va a permanecer en el interior del ovocito. Si se inserta demasiado lejos, se destruirá el ovocito. </li><li> Inyectar con 1-3 pulsos de 120 ms Durationes y 1-10 psi de presión. Si la aguja está lo suficientemente fina, inyectar con flujo continuo a presión constante. Asegúrese de que el volumen de inyección corresponde a 1/5 a 1/3 del volumen de un solo ovocito. </li><li> Después de la inyección, retire la aguja con rapidez para evitar la fuga de los ovocitos. </li><li> Verifique que la solución inyectada permanece dentro del ovocito y que después de unos pocos segundos, la solución inyectada se extiende por todo el ovocito. </li><li> Pasar a la siguiente ovocitos en línea. </li><li> Mantenga algunos embriones no inyectados de cada serie como control negativo para estimar la fluorescencia de fondo durante la búsqueda de los embriones inyectados. </li></ol></li><li> La fertilización, selección de embriones inyectados y cultivo de embriones <ol><li> Fecundar los ovocitos tan pronto como se ha inyectado una serie. Dado que la calidad de los ovocitos disminuye con el tiempo, inyectar y fecundar los ovocitos dentro de 1 hora después del desove 12. </li><li> Dependiendo de la concentración de espermatozoides, añadir 1-5 gotas de esperma de los ovocitos ygirar el plato. NOTA: El sobre fertilización debe ser evidentes en los embriones después de 1 min. </li><li> Permitir a los embriones desprenden de la placa de poli-lisina, mientras se inyecta otra serie de ovocitos. </li><li> La transferencia de los embriones con la transferencia de 600 micras pipeta Pasteur en un plato de Petri de agarosa-revestido. Eliminar los embriones desde el plato de poli-lisina tan pronto como sea posible, si es posible antes de la etapa de 2 células. NOTA: En caso de exposición prolongada a la poli-lisina, los embriones tienden a convertirse en blastulae densamente poblado-aplanada en el lado tocar el fondo del plato. </li><li> En la etapa de 2 células de 4 celdas, seleccione con un microscopio de disección fluorescente con filtro DSR los embriones inyectados con éxito, es decir, los que tienen una morfología normal que exhiben una señal fluorescente de color rojo derivado de rojo fenol. </li><li> Mantener los embriones en cultivo in filtrada ASW en platos de agarosa recubiertas de Petri a 19 ° C hasta que la fase deseada paraimágenes in vivo. </li></ol></li></ol>

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Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinoic+acid-Hox+hierarchy+controls+both+anterior/posterior+patterning+and+neuronal+specification+in+the+developing+central+nervous+system+of+the+cephalochordate+amphioxus.">A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus.</a> Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).</li><li>Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+expression+of+FoxD+reporter+constructs+in+amphioxus+embryos.">Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos.</a> Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).</li><li>Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-regulation+of+the+amphioxus+engrailed+gene:+insights+into+evolution+of+a+muscle-specific+enhancer.">Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer.</a> Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).</li><li>Holland, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amphioxus+genome+illuminates+vertebrate+origins+and+cephalochordate+biology.">The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology.</a> Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).</li><li>Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+the+vertebrate+Tol2+transposable+element+in+Drosophila+melanogaster.">Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster.</a> Gene. 425, 64-68 (2008).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+at+specific+genomic+loci+of+amphioxus+Branchiostoma+belcheri+using+TALEN+method.">Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method.</a> J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).</li><li>Zhang, Q. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+culture+of+two+lancelets+and+production+of+the+second+filial+generations+in+the+laboratory.">Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory.</a> J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).</li><li>Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+aquaculture+of+the+Japanese+lancelet+Branchiostoma+japonicum+for+7+years.">Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years.</a> J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).</li><li>Benito-Guti&#233;rrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+generating+year-round+access+to+amphioxus+in+the+laboratory.">Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory.</a> PLoS One. 8, e71599 (1371).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

En este artículo, presentamos, por primera vez, un protocolo detallado y reproducible para la inyección de B. ovocitos lanceolatum, que, después de B. floridae 13,14 y B. belcheri 15, es, pues, la tercera especie amphioxus, para los que tal técnica se ha descrito. Es importante destacar que el protocolo descrito aquí también incluye la descripción de sistemas de vectores adecuados para la producción de proteínas fluorescentes en B. lanceolatum a...

Durante el desarrollo, una sola célula da lugar a un organismo entero en un proceso altamente complejo que implica tanto las divisiones celulares y movimientos. Para entender mejor los principios biológicos que subyacen a la dinámica del comportamiento celular, los biólogos del desarrollo han comenzado a utilizar en las técnicas de imagen in vivo basado en la fluorescencia. Compartimentos específicos de células, tales como las membranas celulares, o bien pueden ser etiquetados por los tratamientos con colorantes fluorescentes, un enfoque obstaculizado por la falta de especificidad y de penetración en el tejido 1, o por la introducción específica en el embrión de mRNAs exógenos que codifican proteínas fluorescentes 2. Diferentes técnicas pueden ser utilizadas para la prestación eficiente de compuestos exógenos, tales como mRNAs. Estos incluyen, pero no se limitan a, microinyección, electroporación, bombardeo con micropartículas, lipofección y la transducción de 3,4. Aunque todos estos enfoques se puede utilizar para introducir compuestos exógeno en unaembrión en desarrollo, sólo microinyección permite la aplicación de cantidades predefinidas y precisas en cada celda 3. Las técnicas de microinyección se han descrito para los principales sistemas modelo de desarrollo 4 (por ejemplo, moscas de la fruta, gusanos nematodos, pez cebra, ranas, ratones), así como para algunos modelos alternativos 4, incluyendo los utilizados para los estudios comparativos destinados a comprender la evolución de los mecanismos de desarrollo (por ejemplo, las anémonas de mar, gusanos anélidos, erizos de mar, tunicados ascidia, la amphioxus cephalochordate). Cephalochordates, que junto con los tunicados y los vertebrados establecen filo cordados, particularmente modelos muy adecuado para estudiar la evolución de los cordados y la diversificación de los vertebrados de un antepasado de invertebrados 5-8. El linaje cephalochordate divergieron muy temprano durante la evolución cordado; y cephalochordates existentes, que se subdividen en tres géneros (Branchiostoma, Asymmetron y Epigonichthys), se asemejan a los vertebrados, tanto en términos de anatomía general y la arquitectura del genoma 5-8. De los aproximadamente 30 especies de cephalochordates que se han descrito hasta el momento, cinco son disponibles para los estudios y de desarrollo embriológico 6,9: Asymmetron lucayanum (la lancelet Bahama), Branchiostoma floridae (la amphioxus Florida), Branchiostoma lanceolatum (la amphioxus Europea), Branchiostoma belcheri (el anfioxo chino) y Branchiostoma japonicum (el anfioxo japonés). Adultos maduros de tres de estas especies (B. lanceolatum, B. belcheri y B. japonicum) pueden ser inducidas a desovar en la demanda durante la temporada de cría 10,11. Además, al menos por B. lanceolatum, el desove eficiente también puede ser inducida en agua de mar artificial 12, con lo que esta especie cephalochordate particulares accesible para laborators que no tienen acceso a agua de mar natural. La combinación, en B. lanceolatum, de un acceso conveniente y confiable para los embriones con un método de entrega eficiente, tales como la microinyección, hasta ahora la única técnica de administración desarrollada en anfioxo (tanto en B. floridae y B. belcheri) 13-15, permitirá el desarrollo de un novela conjunto de técnicas de manipulación, incluyendo tracing- linaje y los enfoques basados ​​en el comportamiento de células dinámico. Un protocolo para la microinyección eficiente de mRNAs para expresar proteínas fluorescentes en la B. lanceolatum embrión se desarrolla, por lo tanto. Además, para proporcionar un conjunto de herramientas básica para imágenes en vivo de B. embriones lanceolatum, sistemas de vectores se desarrollaron que permiten asociada a la membrana y la expresión nuclear de proteínas fluorescentes. Para la orientación de la membrana, el aumento de la proteína verde fluorescente (EGFP) se fusionó a la caja CAAX HRAS humano y la localización nuclear de mCherry y EGFP seobtenido por fusión a la exón 2B histona pez cebra (H2B) (Figura 1, Archivo 1). Además, con el objetivo de optimizar la traducción de proteínas, las secuencias Kozak y los codones de las construcciones se han modificado y adaptado para el uso en B. lanceolatum. Tomados en conjunto, los vectores de método y de expresión inyección presentados aquí servirán como base para la generación de nuevos enfoques experimentales para cephalochordates, los análisis en particular utilizando la última fluorescencia basada en técnicas de imagen in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1009">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:156px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:413px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Consumables</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 mm Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>culture-treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Filtration unit (Stericup 1L)</td>
			<td style="width:156px;">Fisher</td>
			<td style="width:143px;">W21719</td>
			<td>0.22 micron filtration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Spin-X tubes</td>
			<td style="width:156px;">Costar</td>
			<td style="width:143px;">8160</td>
			<td>0.22 micron filtration tube</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries</td>
			<td style="width:156px;">WPI</td>
			<td style="width:143px;">E212</td>
			<td style="width:413px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>230 mm long</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Aspiration tube</td>
			<td style="width:156px;">Dutscher</td>
			<td style="width:143px;">75056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Capillaries for injection needles</td>
			<td style="width:156px;">Sutter</td>
			<td style="width:143px;">BF 120-94-10</td>
			<td>Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Reagents</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Low-melting agarose</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">114537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Glycerol</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Poly-L-Lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P9155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">H2O Dnase, Rnase-free</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">mMessage mMachine SP6 Transcription kit</td>
			<td style="width:156px;">Ambion</td>
			<td style="width:143px;">AM1340</td>
			<td>mRNA synthesis kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phenol pH8</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">24:1 chloroform:isoamylic alcohol</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">5:1 phenol pH4.7:chloroform</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P1944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Reef Crystal salts (200 kg)</td>
			<td style="width:156px;">Europrix&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Commercial salts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Equipment</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Fluorescent dissecting scope with 200x magnification&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Leica</td>
			<td style="width:143px;">MZ16F</td>
			<td>25x oculars, DSR and GFP2 filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:156px;">Marzhauzer</td>
			<td style="width:143px;">M-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Injector</td>
			<td style="width:156px;">Picospritzer</td>
			<td style="width:143px;">model II or III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Needle puller</td>
			<td style="width:156px;">Sutter</td>
			<td style="width:143px;">P97</td>
			<td>heating-filament needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:297px;">Fine forceps</td>
			<td>FINE SCIENCE TOOLS GMBH</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of fluorescent proteins in branchiostoma lanceolatum by mrna injection into unfertilized oocytes

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

El protocolo se detalla más arriba proporciona la base para la microinyección de B. ovocitos lanceolatum y por lo tanto para la introducción en el desarrollo de B. embriones lanceolatum de ARNm que codifica proteínas fluorescentes para formación de imágenes in vivo. Aunque la técnica es ciertamente robusto y fiable, la tasa de inyecciones exitosas que utilizan este protocolo sigue siendo variable (Tabla 1). La explicación muy probable para este hecho ...

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Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Presentamos aquí la expresión robusta y eficiente de proteínas fluorescentes después de la inyección de ARNm en oocitos no fertilizados de Branchiostoma lanceolatum. El desarrollo de la técnica de microinyección en este cordado basal allanará el camino para que alcance las innovaciones técnicas en este sistema modelo emergente, incluyendo imágenes in vivo y manipulaciones de genes específicos.

Expresión de proteínas fluorescentes en<em&gt; Lanceolatum Branchiostoma</em&gt; Por mRNA La inyección en ovocitos no fecundados

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

10.9K vistas.  Institut Pasteur.  Presentamos aquí la expresión robusta y eficiente de proteínas fluorescentes después de la inyección de ARNm en oocitos no fertilizados de Branchiostoma lanceolatum. El desarrollo de la técnica de microinyección en este cordado basal allanará el camino para que alcance las innovaciones técnicas en este sistema modelo emergente, incluyendo imágenes in vivo y manipulaciones de genes específicos. 

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Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

La manipulación y<em&gt; In Vitro</em&gt; La maduración de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Los ovocitos, seguido de inyección intracitoplasmática de espermatozoides, para estudiar el desarrollo embrionario

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

La transferencia de genes en el pollo auditiva de órgano de<em&gt; En Ovo</em&gt; Micro-electroporación

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

La inducción de la regeneración muscular esquelético aguda por inyección Cardiotoxin

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological questions in cell and developmental biology. In addition, organoids together with recent technical advances in gene editing and viral gene delivery promises to advance medical research and development of new drugs for treatment of diseases. Organoids grown in vitro in basement matrix provide powerful model systems for studying the behavior and function of various proteins and are well suited for live-imaging of fluorescent-tagged proteins. However, establishing the expression and localization of the endogenous proteins in ex vivo tissue and in in vitro organoids is important to verify the behavior of the tagged proteins. To this end we have developed and modified tissue isolation, fixation, and immuno-labeling protocols for localization of microtubules, centrosomal, and associated proteins in ex vivo intestinal tissue and in in vitro intestinal organoids. The aim was for the fixative to preserve the 3D architecture of the organoids/tissue while also preserving antibody antigenicity and enabling good penetration and clearance of fixative and antibodies. Exposure to cold depolymerizes all but stable microtubules and this was a key factor when modifying the various protocols. We found that increasing the ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) concentration from 3 mM to 30 mM gave efficient detachment of villi and crypts in the small intestine while 3 mM EDTA was sufficient for colonic crypts. The developed formaldehyde/methanol fixation protocol gave very good structural preservation while also preserving antigenicity for effective labeling of microtubules, actin, and the end-binding (EB) proteins. It also worked for the centrosomal protein ninein although the methanol protocol worked more consistently. We further established that fixation and immuno-labeling of microtubules and associated proteins could be achieved with organoids isolated from or remaining within the basement matrix.

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

We present protocols for isolation of intestinal 3D structures from in vivo tissue and in vitro basement matrix embedded organoids, and detail different fixation and staining protocols optimized for immuno-labeling of microtubule, centrosomal, and junctional proteins as well as cell markers including the stem cell protein Lgr5.

Inmuno-fluorescente etiquetado de microtúbulos y proteínas centrosómicas en tejido Intestinal Ex Vivo y 3D In Vitro Intestinal organitas

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. The high transfection efficiency permits at least 4 distinct mRNAs to be co-transfected with ~87% efficiency. Most of the electroporated mRNAs are degraded during the first 2 h post-electroporation, permitting time-sensitive experiments to be carried out in the developing embryo. Finally, we describe how to dynamically image live embryos electroporated with mRNAs that encode various subcellular targeted fluorescent proteins.

We report messenger RNA (mRNA) electroporation as a method that permits fast and efficient expression of multiple proteins in the quail embryo model system. This method can be used to fluorescently label cells and record their in vivo movements by time-lapse microscopy shortly after electroporation.

Expresión rápida y eficiente de múltiples proteínas en embriones aviares utilizando la electroporación de ARNm

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human HSC emergence in vitro are required to overcome limitations in studying this complex developmental process. Here, we describe a protocol to generate hematopoietic stem and progenitor-like cells from human dermal fibroblasts employing a direct cell reprogramming approach. These cells transit through a hemogenic intermediate cell-type, resembling the endothelial-to-hematopoietic transition (EHT) characteristic of HSC specification. Fibroblasts were reprogrammed to hemogenic cells via transduction with GATA2, GFI1B and FOS transcription factors. This combination of three factors induced morphological changes, expression of hemogenic and hematopoietic markers and dynamic EHT transcriptional programs. Reprogrammed cells generate hematopoietic progeny and repopulate immunodeficient mice for three months. This protocol can be adapted towards the mechanistic dissection of the human EHT process as exemplified here by defining GATA2 targets during the early phases of reprogramming. Thus, human hemogenic reprogramming provides a simple and tractable approach to identify novel markers and regulators of human HSC emergence. In the future, faithful induction of hemogenic fate in fibroblasts may lead to the generation of patient-specific HSCs for transplantation.

This protocol demonstrates the induction of a hemogenic program in human dermal fibroblasts by enforced expression of the transcription factors GATA2, GFI1B and FOS to generate hematopoietic stem and progenitor cells.

Reprogramación hemogénica de fibroblastos humanos por expresión forzada de factores de transcripción

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls are composed of cellulose and non-cellulosic polysaccharides together with proteins, phenolic compounds and water. 90% of the cell wall is composed of&#160;polysaccharides (e.g., pectins) and arabinogalactan proteins (AGPs). The fluorescent immunolocalization of specific glycan epitopes in plant histological sections remains a key tool to uncover remodeling of wall polysaccharide networks, structure and components.
Here, we report an optimized fluorescent immunolocalization procedure to detect glycan epitopes from AGPs and pectins in plant tissues. Paraformaldehyde/glutaraldehyde fixation was used along with LR-White embedding of the plant samples, allowing for a better preservation of the tissue structure and composition. Thin sections of the embedded samples obtained with an ultra-microtome were used for immunolocalization with specific antibodies. This technique offers great resolution, high specificity, and the chance to detect multiple glycan epitopes in the same sample. This technique allows subcellular localization of glycans and detects their level of accumulation in the cell wall. It also permits the determination of spatio-temporal patterns of AGP and pectin distribution during developmental processes. The use of this tool may ultimately guide research directions and link glycans to specific functions in plants. Furthermore, the information obtained can complement biochemical and gene expression studies.

This protocol describes in detail how the plant material for immunolocalization of Arabinogalactan proteins and pectins is fixed, embedded in a hydrophilic acrylic resin, sectioned and mounted on glass slides. We show cell wall related epitopes will be detected with specific antibodies.

Inmunolocalización fluorescente de proteínas arabinogalactanas y pectinas en la pared celular de los tejidos vegetales

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to promote biodiversity preservation. In felids, most species are threatened with extinction, and domestic breeds are used as a model to increase the efficiency of protocols for germplasm banking. Among oocyte cryopreservation techniques, vitrification is more and more popular in human and veterinary assisted reproduction. Cryotop vitrification, which was at first developed for human oocytes and embryos, has demonstrated to be well-suited for cat oocytes. This method offers several advantages, such as the feasibility in field conditions and the speed of the procedure, which can be helpful when several samples need to be processed. However, the efficiency is strongly dependent on the operator&#8217;s skills, and intra- and inter-laboratory standardization are needed, as well as personnel training. This protocol describes minimum volume vitrification of immature feline oocytes on a commercial support in a step by step field-friendly protocol, from oocyte collection to warming. Following the protocol, preservation of oocyte integrity and viability at warming (as high as 90%) can be expected, although there is still room for improvement in post-warming maturation and embryonic development outcomes.

This manuscript describes a protocol for the minimum volume vitrification of immature cat oocytes with laboratory-made media on commercial supports. It covers every step from oocyte isolation from ex vivo gonads to vitrification and warming.

Vitrificación de Volumen Mínimo de Ovocitos Felinos Inmaduros

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

Separación de células foliculares y ocitos en folículos ováricos de pez cebra

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Evaluación de la integridad del punto de control del ensamblaje del husillo en ovocitos de ratón

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...