El objetivo general de este estudio es mostrar cómo implementar procedimientos automatizados para cultivar y diferenciar las células IPS humanas en linajes neuronales, así como sus imágenes automatizadas. Los procedimientos automatizados estandarizados permiten una baja variación experimental al tiempo que garantizan una alta reproducibilidad fenotípica. Además, el sistema se puede adaptar para el desarrollo de nuevos protocolos.
Demostrando los procedimientos serán Joachim Tager y Elisangela Bressan, post-docs de nuestro laboratorio. En la interfaz gráfica de usuario del sistema automatizado, haga clic en la vista de proceso del instrumento de recursos y seleccione el proceso del instrumento de recursos. Haga clic en Ejecutar proceso de instrumento y ejecute el capó HEPA y los procesos de recarga.
Seleccione los recursos que desea cargar, abra la puerta y cargue las placas de cultivo celular y las puntas desechables en las posiciones adecuadas según lo indicado por las imágenes emergentes. A continuación, descontaminar la puerta con 70%etanol antes de cerrar y ejecutar el proceso de descontaminación. El sistema será esterilizado por radiación UV durante 30 minutos.
Para cargar las placas con medio de cultivo o reactivo de disociación, ejecute el paso de la campana HEPA de ejecución y abra la puerta de la estación de manipulación de líquidos. Después de la descontaminación con 70%etanol, coloque los depósitos en la cubierta a la posición asignada y des-lid ellos. Cierre la puerta de la estación de manipulación de líquidos y, a continuación, ejecute el proceso del instrumento de recursos InitHepaHood para apagar la campana HEPA.
Para ejecutar un método de referencia cultural automatizado, en la vista de calendario de la interfaz gráfica de usuario, haga clic en Agregar paso de proceso y seleccione la línea de celda que se utilizará en el experimento. Utilice el asistente para seleccionar el proyecto y marcar el lote que se va a utilizar. Haga clic en la punta de flecha hacia la derecha y vaya a la página siguiente del asistente para seleccionar el paso de proceso que se va a ejecutar.
En la última página del asistente, programe el experimento y establezca las variables de detalles de parámetros adecuadas necesarias para ejecutar el método. A continuación, haga clic en Aceptar. Después de cargar un tubo de 50 mililitros con la suspensión humana de la célula IPS, placas de cultivo recubiertas de carga para recibir las células en el estante y ejecutar la siembra de placas desde el método de tubos. Para contar las células en el citómetro de imágenes Brightfield, prepare automáticamente una placa de conteo de 384 pozos con suspensión celular en la cubierta y utilice el brazo robótico para transferir la placa de conteo de 384 pozos de la cubierta al citómetro de imagen Brightfield.
Después de contar, el sistema devolverá la placa a su posición original y transferirá un cultivo recubierto o una placa de ensayo desde el estante a la cubierta de pipeteo. A continuación, el sistema sembrará las celdas en el número definido por el usuario y los volúmenes adecuados para la placa y se mezclarán por pipeteo. Después de la siembra, la placa se moverá al agitador en la cubierta durante 10 segundos a 500 revoluciones por minuto para la distribución celular antes de ser transferida a la incubadora de dióxido de carbono.
Para evaluar la confluencia automatizada, ejecute el método de confluencia check y seleccione un lote que contenga al menos una placa de cultivo y ninguna placa de ensayo. En la sección de detalles de parámetros, especifique iPSCf_2020 para la adquisición de imágenes en la configuración de análisis de imágenes. A continuación, el sistema transferirá la primera placa de la incubadora al citómetro de imagen Brightfield e imágenes de la confluencia celular.
Para cambiar el cultivo de celdas o los medios de la placa de ensayo, ejecute el método de cambio de medios de placas de cultivo y seleccione un lote que contenga solo placas de cultivo. El sistema transferirá las placas a la cubierta e inclinará las placas para permitir la aspiración del sobrenadante. El sobrenadante se desechará al módulo de recogida de residuos y desechará las puntas y se añadirán 12 mililitros de medio fresco a cada plato.
A continuación, el sistema volverá a tapar las placas y devolverá las placas a la incubadora de cultivo celular. Alternativamente, para cambiar el medio de las placas de ensayo, ejecute el cambio de medios del método de placas de ensayo. Para subcultivar las celdas, ejecute la subcultivación del método de células adherentes y seleccione el lote que contiene las placas de cultivo que necesitan subcultivación.
Después de desechar el medio, el sistema lavará las células una vez con ocho mililitros de PBS por placa antes de agregar ocho mililitros de EDTA milimétrica a las células. Después de ocho minutos en la cubierta con opción de inclinación, el EDTA será reemplazado por 12 mililitros de medio fresco por placa. El sistema sacudirá las placas a 2.000 revoluciones por minuto durante un minuto para desalojar las colonias antes de triturar las células con cinco ciclos de pipeteo para dividir las colonias en grupos de 50 a 80 micras.
Las células se transferirán a un tubo de 50 mililitros en la cubierta antes de sembrarlas en una proporción de división de uno a siete. Para obtener un alto contenido automatizado, realice imágenes celulares de alto rendimiento, ejecute el método de creación de imágenes y seleccione un lote que contenga al menos una placa de ensayo y ninguna placa de cultivo. A continuación, el sistema transferirá una placa de ensayo al microscopio confocal automatizado para obtener imágenes.
Asegúrese de seleccionar los ID de lote y placa correctos mientras realiza los pasos de proceso necesarios. Los cultivos hiPSC deben ser monitoreados diariamente para el crecimiento y analizados para su porcentaje de confluencia en el citómetro de imágenes de Brightfield. Después de la transferencia y la referencia cultural manual o automatizada del sistema, las células exhiben una expresión típica de la célula madre y del marcador de pluripotencia.
Las neuronas diferenciadas en el sistema de cultivo automatizado demuestran una morfología similar y la organización de la red neuronal a las neuronas cultivadas manualmente. Después de seis días de diferenciación, las neuronas corticales diferenciadas automáticamente son positivas para la expresión de marcador de capa cortical de clase III específica de neuronas y. Después de ocho días, las células también expresaron la proteína asociada a los microtúbulos 2, la molécula de adhesión de células neuronales, y la sinapsis I, así como marcadores de neuronas corticales.
La expresión muy baja o nula de estos marcadores se observa en hiPSC. Este sistema también se puede utilizar para establecer un ensayo automatizado de crecimiento de neurita de células vivas que permite medir longitudes de neurita durante 11 días de diferenciación sin intervención manual. El uso del sistema de cultivo automatizado para realizar cambios medios durante un período de cultivo de 65 días facilita la diferenciación de hiPSC en neuronas dopaminérgicas de cerebro medio con la organización celular y morfología esperadas.
Además del crecimiento de la neurita, otros ensayos fenotípicos automatizados relevantes para estudiar la neurodegeneración, por ejemplo, los focos de ARN de translocación TDP-43 y la captación de fibría de alfa-sinucleína, se pueden explorar utilizando este formato de alto rendimiento y alto contenido.
