Este protocolo facilita el uso de neuronas derivadas de células madre pluripotentes humanas para aplicaciones de cribado de alto contenido. Es particularmente adecuado para el ensayo de sinapsis, que en las neuronas humanas requieren largos períodos de cultivo. Demostramos el replata de las neuronas de platos de gran formato en pozos múltiples compatibles con HCS de una manera que preserva su viabilidad.
De manera anti-intuitiva, mostramos que extender la incubación de la proteasa antes de resuspending y replating produce una supervivencia neuronal mejorada. Las neuronas derivadas de células madre pluripotentes humanas son cada vez más relevantes en las áreas de investigación básica, desarrollo de fármacos y medicina degenerativa. Este método de valoración suave se puede utilizar para resuspend cualquier gran monocapa de células que tengan una gruesa red de procesos.
Además de los iPSC humanos, se puede utilizar para reoplatar el cultivo de las neuronas primarias o para resuspenderlos para la clasificación de hechos o la secuenciación de una sola célula. Es importante seguir los pasos de los protocolos cuidadosamente y con frecuencia monitorear el desprendimiento mediado por la proteasa de las neuronas de la placa. El tiempo óptimo de incubación puede variar, dependiendo del cultivo.
La demostración visual permite incluso a los investigadores inexpertos reproducir este procedimiento. Comience enjuagando suavemente la placa de neuronas diferenciadas con PBS. Disperse el PBS por la pared de la placa y no directamente en las células para evitar interrumpirlos.
Aspirar el PBS desde el borde del plato mientras lo inclina, teniendo cuidado de no tocar las células. Aplicar al menos un mililitro de enzima proteolítica por placa de 10 centímetros. Y devolver las células a la incubadora durante 40 a 45 minutos.
Durante la incubación, revise las neuronas en un microscopio de contraste por fases y continúe el tratamiento con proteasa hasta que la red neuronal se separe completamente de la placa y comience a separarse. Cuando las neuronas se hayan desprendido, detenga la digestión añadiendo cinco mililitros de medios FRESCOS DEMEM por cada mililitro de proteasa. Utilice una pipeta serológica para valorar suavemente las células contra la placa de cinco a ocho veces, asegurándose de no aplicar demasiada presión.
Tensar las células a través de una malla de 100 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros, gota a gota. Y enjuague el colador con cinco mililitros adicionales de medios DMEM frescos. Utilice una centrífuga de sobremesa para girar las células hacia abajo a 1000 veces G durante cinco minutos.
Después de la centrifugación, devuelva el tubo cónico al gabinete de bioseguridad y aspire la mayoría de los medios, dejando 250 microlitros para mantener las células húmedas. Resuspender suavemente las células en dos mililitros de medios DMEM frescos y luego pasarlas a través del final de una pipeta serológica de cinco mililitros. Finalmente, invierta el tubo de dos a tres veces.
Usa un hemociclo y un azul tripan para contar las células viables. Y luego DMEM a la concentración deseada. Añadir suplementos apropiados al tubo, dependiendo de los requisitos de la línea celular específica y mezclar suavemente las células inclinando el tubo cónico de dos a tres veces.
Aspirar el recubrimiento de laminin de una placa de 24 pozos y enjuáguelo una vez con PBS. Aspirar el PBS. Y aplique la solución celular a cada pozo en un movimiento de la figura ocho para evitar el aglutinamiento.
Cuando termine de enchapar las células, devuelva la placa a la incubadora establecida en 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Brevemente vórtice la solución de acciones del reportero de muerte celular temprana y agréguelo a los pozos de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Espera 20 minutos.
Y luego imagen de las células vivas y muertas en los múltiples pozos de fondo de vidrio. La prolongación de la incubación de la proteasa permite aflojar la red neuronal dentro de la hoja levantada de células. Esto se traduce en una reducción de la muerte celular en el momento de la disociación, así como resulta en una recuperación más eficiente en los días siguientes.
Utilizando el procedimiento de incubación enzimática extendida, los cultivos exhiben una duplicación aproximada de la viabilidad celular durante los días después del replating y una menor densidad de células muertas o moribundas. La fase de transición de la diferenciación neuronal tiene lugar durante varios días, durante los cuales las células expresan gradualmente marcadores neuronales en etapa tardía. Estos marcadores se detectan inmediatamente en cultivos que fueron replatados después de cuatro semanas de pre-diferenciación.
El protocolo de proteasa extendida también mejora moderadamente el crecimiento de la neurida. Se mejora tanto la longitud total de la neurida como el crecimiento de la dendrita. Replating también es útil para estudiar las sinapsis.
Apenas una semana después del replating, se observaron marcadores para las proteínas pre y post-sinápticas. Además, la actividad eléctrica a partir de la despolarización espontánea y las corrientes impulsadas sinápticamente es detectable utilizando imágenes de calcio o matrices multielectrodos. Este procedimiento de replating se puede adaptar a muchos tipos de aplicaciones.
Además de la detección de alto contenido para identificar posibles compuestos terapéuticos, podría utilizarse para imágenes de conos de crecimiento o grabaciones de matrices multielectrodos. La disociación mecánica de las neuronas que ya han formado largos procesos es estresante. La incubación enzimática alargada y la valoración suave de las células son pasos esenciales para el éxito de este procedimiento.
