El objetivo general de este paradigma es evaluar el comportamiento defensivo complejo en roedores. Este protocolo es significativo porque facilita las investigaciones sobre las transiciones entre comportamientos defensivos, por lo que es ideal para los investigadores interesados en estudiar respuestas adaptativas complejas a la amenaza. Este protocolo utiliza estímulos de condición temporalmente precisos para provocar la transición entre respuestas defensivas, lo que nos permite estudiar tanto, congelación condicionada y comportamientos de vuelo dentro de sujeto individual.
El uso de este modelo para descubrir los mecanismos de comportamiento defensivo puede proporcionar información sobre la disfunción relacionada con el TEPT y los trastornos de pánico y podría ayudar en el desarrollo de terapias novedosas. Para configurar los protocolos de comportamiento, en el programa, defina el SCS, estableciendo los estímulos que se entregarán como un tono puro de diez segundos, o un ruido blanco de diez segundos, y definiendo los intervalos entre pruebas que se presentarán pseudo-aleatoriamente después de cada prueba. Para configurar el seguimiento de software, coloque un ratón de prueba en cada contexto relevante, defina el centro de gravedad y ajuste el tamaño del contorno.
Utilice el tamaño de las cámaras y las dimensiones de píxeles de la cámara para determinar el coeficiente de calibración. A continuación, genere el código de pulso TTL para sincronizar los marcadores de evento del equipo central con sus apariciones en tiempo real. Antes de comenzar un experimento, encienda el controlador de caja de acondicionamiento de miedo, el amortiguador y el software de grabación de vídeo.
Monte un altavoz superior a los contextos para la entrega de los estímulos auditivos en 75 decibelios y establezca un generador de audio programable para generar estímulos auditivos en un horario predefinido. Después de confirmar que el tone y el ruido blanco son funcionales, establezca el sistema para la adquisición de datos y transporte de ratones macho o hembra de tres a cinco meses de edad a la sala de acondicionamiento. Antes de comenzar el ensayo de preacondicionamiento, limpie una cámara cilíndrica cilíndrica cilíndrica de 30 centímetros de diámetro y 30 centímetros de alto con un ácido acético del 1% que se utilizará como cámara Context A.
Para el preacondicionamiento, coloque el ratón en el contexto A y permita que se aclimata durante tres minutos antes de exponer el ratón a cuatro senderos SCS de 20 segundos con un intervalo de interrreloj pseudoaleatorio promedio de 90 segundos. Después de 10 minutos de aclimatación, transfiera un ratón a la cámara contextual A e active inmediatamente el sistema de acondicionamiento del miedo y los programas de recopilación de datos. Antes de comenzar un experimento de acondicionamiento del miedo, limpie un recinto rectangular de al menos 35 centímetros de altura y 25 por 30 centímetros con un suelo de rejilla eléctrica con un 70% de etanol que se utilizará como cámara Context B.
A continuación, conecte el amortiguador con el suelo de la red eléctrica de la cámara Context B y defina la frecuencia, el inicio y la duración de los amortiguadores en el programa informático adecuado. Cuando se hayan ajustado todos los parámetros, compruebe que la intensidad del choque se entrega correctamente desde el amortiguador y el suelo de la rejilla. En los días dos y tres, coloque el ratón en la cámara context B durante tres minutos antes de exponer al animal a cinco emparejamientos de la co-terminación scs con un choque de pie ac de un segundo, 0,9 miliamperios y un intervalo inter-ensayo medio de 120 segundos.
Al final de la sesión, vuelva a poner el ratón en la jaula de casa. Dependiendo del objetivo del experimento, someter a los animales a una sesión de recuperación, en el cuarto día, coloque el ratón en la cámara del contexto A durante tres minutos antes de presentar al animal cuatro ensayos de SCS sin choque de pie con un intervalo de ensayo entre pseudoaleatorio promedio de 90 segundos durante 590 segundos para probar la respuesta del animal a Fear Recall. O, para probar la extinción del miedo, en el cuarto día, coloque el ratón en la cámara context B durante tres minutos antes de someter al animal a 16 ensayos de SCS sin choque de pie con un intervalo de ensayo entre pseudoaleables promedio de 90 segundos durante un período de 1.910 segundos.
Para cuantificar el comportamiento del ratón, al final del experimento, haga que un observador ciego al análisis puntúe los vídeos grabados para el comportamiento de congelación utilizando umbrales automáticos del detector de congelación seguidos de un análisis fotograma a fotograma de los cambios en píxeles. Defina la congelación como un cese completo de los movimientos corporales, excepto los necesarios para la respiración durante un mínimo de un segundo. Puntúe un salto como instancia cuando las cuatro patas salgan del suelo, lo que resulta en un movimiento vertical y/u horizontal.
Cuando se haya analizado todo el segmento, exporte el archivo marcado con marcadores de congelación, salto y evento y extraiga los eventos relevantes de los períodos de tiempo de interés definidos en una hoja de cálculo. Para calcular la duración de la congelación, reste la hora de inicio de la hora de finalización para cada período de prueba respectivo. Suma el número total de saltos de una duración de prueba determinada.
Para calcular la velocidad del ratón, realice un seguimiento de las coordenadas desde el movimiento del eje XY fotograma a fotograma del centro de gravedad del ratón. Para calcular las puntuaciones de vuelo, divida la velocidad media durante cada SCS por la velocidad media durante el PRE-SCS de diez segundos y agregue un punto por cada salto de escape. Una puntuación de vuelo de uno indica que no hay ningún cambio en el comportamiento del vuelo desde el período anterior al SCS.
A continuación, analice los datos para obtener importancia estadística utilizando un programa de software de análisis estadístico adecuado. Las presentaciones de SCS en la sesión previa a la exposición no provocan respuestas de vuelo o congelación en ratones. El análisis conductual durante el acondicionamiento revela que el componente Tono del SCS mejora significativamente la congelación en comparación con la congelación durante el PRE-SCS.
Las puntuaciones de vuelo cambiaron significativamente a lo largo de las sesiones, y los ratones exhiben velocidades más altas y más saltos a la señal de ruido blanco en comparación con la señal tone. Los ratones muestran una clara transición de comportamiento defensivo, exhibiendo puntuaciones de vuelo más bajas durante el Tono y puntuaciones de vuelo más altas durante el Ruido Blanco, con lo contrario observado para las respuestas de congelación. Los ratones sometidos a 16 pruebas de entrenamiento de extinción demuestran una rápida extinción del vuelo condicionado, con puntuaciones de combate durante el primer bloque de cuatro pruebas que miden más alto durante white noise en comparación con la señal Tone.
Al final de la sesión de extinción, el comportamiento del vuelo ya no se provoca por ninguna de las dos señales. Congelar el tono es significativamente mayor que congelar el ruido blanco para el primer bloque de cuatro ensayos durante la extinción. La congelación inducida por el tono disminuye durante los 16 ensayos de extinción, mientras que se observa un aumento de la congelación mediada por ruido blanco.
En la sesión recall, la exposición al ruido blanco en un contexto neutro no provoca vuelo, ya que las puntuaciones de vuelo están por debajo de una. Más bien, las presentaciones de ruido blanco en el contexto neutro provocan respuestas de congelación que son más altas que las provocadas por el Tono. Es importante limpiar el contexto durante todo el tiempo, y es fundamental probar la amplitud de choque y el nivel de presión sonora antes de iniciar un experimento.
Este paradigma está siendo utilizado actualmente por grupos que están interesados en entender las complejidades del comportamiento defensivo, y se pueden utilizar para promover nuestra comprensión de la selección de acción defensiva.
