Este protocolo permite el análisis de la estructura tridimensional de muy grande humano en la microscopía de ballet de tejido adiposo de ratón. Facilitar la vinculación de la disfunción patológica con cambios estructurales de tejidos adiposos. Este proceso de limpieza es muy simple, muy bien adaptado para limpiar el tejido adiposo humano en ratones calientes y utilizar menos disolvente tóxico como etanol o salicilato de metilo en comparación con otros protocolos claros.
Comience sumergiendo el ratón cosechado o el tejido adiposo blanco humano en al menos 10 mililitros de formaldehído de 4% de potencia en PBS en un tubo de plástico de 15 mililitros preferentemente bajo una capucha química. Agitar el tejido en una placa de rodadura a temperatura ambiente durante una hora antes de transferir el tubo a una placa de rodadura a cuatro grados Celsius durante la noche. A la mañana siguiente enjuague el tejido adiposo blanco fijo en 10 mililitros de PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente para eliminar todos los rastros de fijador y transferir el tejido a un tubo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de 0,3% de glicina en PBS durante una incubación de una hora a temperatura ambiente en un agitador orbital a 100 revoluciones por minuto.
Cuando se hayan acaloder los grupos de aldehído libre restantes, sumerja el tejido en un tubo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de 0,2% Tritón X-100 en PBS durante una incubación de dos horas con temblores a 37 grados centígrados. Al final de la incubación tratar el tejido con 10 mililitros de 0.2%Tritón X-100 y 20%DMSO con temblor a 37 grados Celsius durante la noche. A la mañana siguiente sumerja el tejido en un tubo de plástico de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de 0,1%Tween 20, 0,1%Triton X-100, 0,1% desoxicolato y 20%DMSO en PBS durante una incubación de al menos 24 horas a 37 grados Celsius con temblor.
Al final de la incubación, enjuague el tejido con 10 mililitros de 0,2% Tritón X-100 en PBS en un agitador orbital a 100 revoluciones por minuto durante una hora. Seguido por la inmersión en 15 mililitros de 0.2%Triton X-100, 10%DMSO y 3%BSA en PBS durante 12 horas a 37 grados Celsius con temblor. Para la tinción del tejido adiposo blanco.
Transfiera el tejido a 300 microlitros de 0,2%Tritón X-100, 10%DMSO y 3%BSA en PBS, complementados con los anticuerpos primarios de interés en un microtubo de 1,5 mililitros, protécterelo de la luz con papel de aluminio y coloque el tubo en un tubo Falcon de 50 mililitros. Coloque el tubo en el agitador orbital durante una incubación de dos días a 37 grados Celsius con temblor. Al final de la incubación enjuague el tejido dos veces en 10 mililitros de 0.2%Triton X-100, 10%DMSO y 3%BSA en PBS durante cinco horas a 37 grados Celsius con temblor y protección contra la luz.
Después del segundo enjuague lavar el tejido en 10 mililitros de 0.2%Triton X-100, 10%DMSO y 3%BSA y PBS durante 16 a 48 horas a 37 grados Celsius con temblor, luego transfiera el tejido a un tubo de 1,5 mililitros que contenga 300 microlitros de 0,2%Tritón X-100, 10%DMSO y 3%BSA en PBS, complementado con los anticuerpos secundarios apropiados y proteger el tubo de la luz usando papel de aluminio. Después de una incubación de dos días a 37 grados Celsius en una coctelera, lave el tejido dos veces en 10 mililitros de 0.2%Tritón X-100, 10%DMSO y 3%BSA en PBS durante cinco horas a 37 grados Celsius con temblor protegido de la luz. Después del segundo lavado, enjuague el tejido en un tubo que contenga 10 mililitros de 0,2%Tritón X-100 fresco, 10%DMSO y 3%BSA en PBS durante 16 a 48 horas a 37 grados Celsius con temblor y protección de la luz.
Seguido de un lavado de dos horas en 10 mililitros de PBS solo a 37 grados Celsius con temblor y protección de la luz. Para la limpieza de tejido adiposo blanco al final del lavado PBS sumergir el tejido y 10 mililitros de una serie de concentración de etanol de envío ascendente para una incubación de dos horas por concentración a temperatura ambiente con temblores protegidos de la luz como se indica. A la mañana siguiente sumerja el tejido en una botella de vidrio de 20 mililitros con una tapa de plástico que contenga cinco mililitros de salicilato de metilo en una campana de humo.
El tejido adiposo blanco todavía es claramente visible en esta etapa. Agitar el recipiente protegerlo de la luz a temperatura ambiente durante al menos dos horas. El tejido adiposo blanco se convierte en un trasplante completo.
Para la imagen confocal 3D del tejido adiposo blanco teñido y transparente montar una cámara de imágenes metálicas equipada con un fondo de vidrio y en una campana de humo transferir el tejido a la cámara. Llene la cámara con salicilato de metilo fresco. Finalice el montaje de la cámara añadiendo un pequeño resbalón de cubierta para estabilizar el tejido y un gran resbalón de cubierta para cerrar la cámara.
Coloque la cámara en una etapa de microscopio confocal invertido para la toma de imágenes de tejido con bajo aumento para generar unos pocos mapas 3D de centímetro cúbico de toda la muestra de tejido adiposo. Después de la generación de mapas 3D, utilice un objetivo de aire de larga distancia 20X que proporcione una buena relación entre la resolución y la profundidad para seleccionar varias áreas para el muestreo de tejido con un aumento más alto. Para la segmentación de celdas, convierta pilas 3D en el formato de software para liberar espacio de memoria.
Antes de abrir el módulo celular del software. Cambie el ajuste de detección celular a la tinción de membrana plasmática y seleccione el canal fluorescente del marcador utilizado para delinear la periferia celular. A continuación, configure los umbrales, proporcione un rango de los tamaños de celda esperados y ejecute la segmentación.
Los efectos de la limpieza en el tejido adiposo blanco humano y ratón se pueden observar a simple vista. La limpieza también mejora drásticamente la profundidad de la imagen del tejido que se puede adquirir. Y facilita la generación de imágenes 3D de tejido entero y la generación de mapas 3D de la ampliación 4X.
El mapeo 3D permite además la selección de diferentes áreas de interés a una ampliación de 20X a una profundidad de dos milímetros. La tinción específica de gotas de lípidos y adipocitos se puede lograr utilizando anticuerpos perilipina y anti-GLUT4 respectivamente. Los vasos sanguíneos se pueden detectar utilizando un anticuerpo CD31 o una inyección intravenosa de Lectin DyLight 649 poco antes del sacrificio.
Los macrófagos y las células T se pueden visualizar utilizando anticuerpos anti-fitoerytrina CD301 y anticuerpos azules anti TCR beta Pacífico. La red nerviosa periférica se puede detectar utilizando anticuerpos anti tirosina hidroxilasa. Usando estos etiquetados se puede determinar el tamaño medio y la distribución del tamaño de los adipocitos y la densidad de la red de los vasos sanguíneos dentro del tejido adiposo.
Es crucial seguir el tiempo de ocupación como se ha demostrado porque una mala preparación de la muestra no resultará en una buena calidad de imagen. Este protocolo se puede combinar con un avanzado sistema de imágenes o se puede acoplar al software gratuito de análisis de imágenes posterior al procesamiento.
