Estudios recientes han puesto de relieve el papel crítico de la angiogénesis y la innovación simpática en la remodelación de tejidos adiposos durante el desarrollo de la obesidad. Aquí demostramos un método de inmunofluorescencia modificado que apoya eficientemente los vasos sanguíneos y las fibras nerviosas en el tejido adiposo. Nuestro enfoque es directo y eficiente sin comprometer la eficiencia permanente y la calidad.
Adquirimos las imágenes mediante microscopía confocal. La alta resolución de las imágenes nos permite reconstruir las redes de vasos sanguíneos y analizar con precisión sus características. Comience este procedimiento con anestesia y perfusión de seis semanas C57 Black-6J ratones macho como se detalla en el protocolo de texto.
Diseccionar problemas adiposos blancos y marrones de los ratones. Use tijeras para dividir las muestras de tejido en trozos pequeños de trozos. Transfiera los trozos pequeños con las pinzas esterilizadas en los casetes de incrustación de tejido con el etiquetado adecuado de las muestras de tejido en los casetes.
Sumerja los casetes incrustados que contienen muestras de tejido en la solución de fijación a cuatro grados centígrados durante 24 a 48 horas. Transfiera las pequeñas pinzas que se esterilizaron en un Petri Dish. Lave las muestras 3 veces con el cepillo 1x tampón PBS a 0,5 mililitros por lavado.
Ahora corte las muestras de tejido fijo en aproximadamente dos cubos de milímetros cúbicos con las tijeras esterilizadas. Para la permeabalización, transfiera las muestras a un tubo de 1,5 mililitros que contenga un mililitro de 1%Tampón De Tritón PBS y gire suavemente los tubos a temperatura ambiente durante 1 hora a 18 RPM. Después de una hora, retire cuidadosamente el búfer 1%Triton PBS laviendo las muestras tres veces añadiendo el 1x PBS directamente en los mismos tubos.
Durante cada lavado, invierta los tubos varias veces. Para el bloqueo, añada 0,5 mililitros de tampón de bloqueo a las muestras y a la incubadora a temperatura ambiente durante dos horas con una rotación suave. Para preparar 0,4 mililitros de solución primaria de anticuerpos, diluir dos microlitros de anti Endomusina y dos microlitros de anticuerpos de lanosa hidroxi de tirosina hasta 396 microlitros de tampón de bloqueo.
Vórtice y girar hacia abajo para recuperar el volumen. Ahora, retire cuidadosamente el tampón de bloqueo de los trozos de tejido. Añadir 100 microlitros de la solución de anticuerpos primarios preparados en tubos e incubar a cuatro grados de celcius durante la noche.
Al día siguiente, recoja cuidadosamente la solución de anticuerpos primarios para su reutilización si lo desea. Lave las muestras tres veces con 1 PBST a 500 micro litros por lavado durante 30 minutos con una rotación suave a 18 RPM. Para la preparación de la solución de anticuerpos secundarios, diluir dos microlitros de harina-flouro conjugado anti-dios IGG en dos microlitros de harina de harina conjugada anti-rabid IGG en 396 microlitros de tampón de bloqueo.
Vórtice y girar brevemente para recoger todo el líquido. Ahora, retire el último tampón de lavado de las muestras. Añadir 100 microlitros de solución de anticuerpos secundarios en tubos.
Incubar las muestras a temperatura ambiente durante dos horas con rotación suave a 18 RPM. Después de retirar cuidadosamente la solución de anticuerpos secundarias, lave las muestras tres veces con 1 PBST a 500 microlitros por lavado durante 30 minutos cada una con rotación suave a 18 RPM. Para el aclaramiento óptico, sumerja las muestras en un mililitro de 90% de glicerol y mantenga las muestras a cuatro grados de celcius en la oscuridad hasta que se vuelvan transparentes.
Agregue aquí un aislador de silicio a la diapositiva para crear un pozo para imágenes de volumen. Mantenga la altura de la silicona a o ligeramente inferior a la de la muestra. Transfiera cuidadosamente las muestras al pozo y llénelo con el medio de montaje.
Poner un cubreobjetos en la superficie y sellar los cuartos del cubreobjetos con medio de alta viscosidad. Deje que el medio de montaje se cure durante 24 horas a temperatura ambiente y oscuridad. Una vez finalizado el curado, selle completamente los bordes del cubreobjetos para una mayor longevidad de la muestra.
Adquiera imágenes de pila Z con el objetivo 20 veces de un microscopio confocal y su software correspondiente. Inicie el sistema. Haga clic en la pestaña de configuración y active tanto el láser Argon como el láser He-Ne 633.
Haga clic en la pestaña adquirir. En el panel de líneas láser visibles, mueva los reguladores de intensidad correspondientes hacia arriba para elegir las líneas láser hasta 488 nanómetros y 633 nanómetros. Inicialmente, las intensidades se pueden ajustar a 20 a 30%Ahora seleccione el espejo dicroico triple 488, 561, 633.
Active los multiplicadores de fotos haciendo clic en las casillas de verificación activas. Elija el fotomultiplicador para la emisión ejercida por el láser de 488 nanómetros y fotomultiplicador 34 para el láser de 633 nanómetros. Establezca el rango de longitud de onda en entre 500 y 550 nanómetros para el multiplicador de fotos uno.
En 650 a 750 nanómetros, para el multiplicador fotográfico tres. Seleccione el pseudo color que se utilizará para la visualización de la imagen haciendo doble clic en el rectángulo de color junto a cada multiplicador de fotos y eligiendo un color en el menú emergente. Ahora haga clic en vivo para comprobar la imagen en las muestras.
Utilice el número de posición Z para seleccionar un plano de enfoque dentro de la región XY de interés. Ajuste el brillo de las imágenes girando la intensidad del láser, la ganancia inteligente y el desplazamiento. Para cada canal de fluorescencia, realice este ajuste en el modo de visualización de la tabla de búsqueda rápida.
Haga clic en el botón de la tabla de búsqueda rápida para entrar en el modo de tabla de búsqueda rápida en el que los píxeles saturados se muestran en azul para ayudar a la configuración del nivel de brillo adecuado. Haga clic dos veces en el botón de la tabla de búsqueda rápida para volver al modo de visualización de pseudo color. Durante el escaneo, gire el nob de la posición Z en sentido contrario a las agujas del reloj para mover el plano de enfoque a un extremo del volumen de interés.
A continuación, haga clic en la punta de flecha final para establecer el escaneo y la posición. Gire el número de posición Z en el sentido de las agujas del reloj para mover el plano de enfoque a través de la muestra al otro extremo del volumen de interés. A continuación, haga clic en la punta de flecha de inicio para establecer la posición de inicio del escaneo.
Ajuste el tamaño del paso Z a tres micras. Cambie la calidad de la imagen seleccionando un formato de 1024 por 1024, una velocidad de 100 Hz y un promedio de línea de dos. Seleccione iniciar la adquisición de la imagen de pila Z Para la proyección máxima de la pila de imágenes adquirida, Haga clic en la pestaña proceso y, a continuación, en la herramienta;seleccione proyección 3D e introduzca el máximo en la lista de métodos sin cambios en umbral X, Y y Z.Set a cero, haga clic en aplicar.
La intensidad máxima del volumen Z se apilará en una imagen 2D que se muestra. Para analizar las imágenes 2D a través de software de código abierto, abra las imágenes apiladas en el software. Ajuste el diámetro y la intensidad del recipiente hasta que todas las estructuras del recipiente se puedan seleccionar correctamente.
Seleccione ejecutar análisis y exporte los datos siguiendo las instrucciones del software. Para analizar las imágenes 3D a través del software de licencia, abra los datos sin procesar de las imágenes con el software. Ajuste el umbral de intensidad y otros parámetros hasta que las estructuras del recipiente en cada capa del volumen Z se segmenten correctamente.
Esquelada la pila de imágenes binarizadas resultante para obtener un gráfico especial. Analizar las características del segmento seleccionado y exportar los datos siguiendo las instrucciones del software. Se recogieron el tejido adiposo blanco epidídmico de la región distal, la región medial del tejido adiposo blanco subcutáneo lumbar dorsal y la región medial del tejido adiposo marrón intraescapular.
Después de una mancha de montaje completo, los troncos de tejido fueron montados e imágenes con el microscopio confocal. Más vasos sanguíneos estaban manchados positivamente. Con el anticuerpo anti-Endomusin en el tejido adiposo blanco subcutáneo incubado por glicerol, lo que sugiere que el paso de limpieza es crítico para la tinción completa de los vasos sanguíneos.
Para determinar si los vasos sanguíneos y las fibras nerviosas presentan diferentes patrones entre los depos con este método, la tinción de fluorescencia comunal se realizó en el tejido adiposo con anticuerpos con anti-Endomusina para mostrar los vasos sanguíneos y con laosa hidroxi de tirosina para mostrar fibras nerviosas. Curiosamente, los resultados muestran que eran significativamente más vasos sanguíneos que las fibras nerviosas en el tejido adiposo marrón en comparación con el tejido adiposo blanco. Entre el tejido adiposo blanco, el tejido adiposo blanco subcutáneo presentaba una mayor densidad de vasos sanguíneos que el tejido adiposo blanco epidídmico.
Cabe destacar que mientras que las fibras nerviosas se expandieron en paralelo con los vasos sanguíneos, no mostraron una co-localización significativa. El área del recipiente, el número de uniones y la longitud del tubo se midieron cualitativamente con el método 2D en estos tres tipos de tejido adiposo y encontraron resultados similares. Este método cos-dens eficientemente vasos sanguíneos y fibras nerviosas y tejido adiposo.
Suena como una herramienta útil para estudiar el cambio dinámico en el tejido adiposo durante el desarrollo de la obesidad. Potente aire es tóxico. Por favor, lleve a cabo los pasos involucrados P-ifa en un contacto con la piel más amplio y la inhalación y manipule adecuadamente el P-ifa Porque los rayos láser se han convertido en microscopio focal pero han dañado el ojo.
Evitar la exposición ocular a los haces que provienen del objetivo,
