Los autores agradecen a la facilidad de la base de imágenes INRA MIMA2 (INRA, UMR1198, Jouy-en-Josas) y para el personal de la unidad IERP (UE 0907, el INRA, Jouy-en-Josas) para el cuidado de los animales y las instalaciones. También nos gustaría dar las gracias a IH Mather, MC Neville y S. Tooze por darnos antibodie muy útil.

Ratones CD1 fueron criados en el INRA (UE0907 IERP, Jouy-en-Josas, Francia). Todos los aspectos éticos del cuidado de los animales cumplen las directrices pertinentes y los requisitos de licencia establecidos por el Ministerio de Agricultura francés. Los procedimientos utilizados fueron aprobados por el comité de ética local (acuerdo 12/097 de la Comethea Jouy-en-Josas / AgroParisTech). 1. Glándula Mamaria Preparación de la muestra <ol><li> Ratón disección de la glándula mamaria <ol><li> La eutanasia a los ratones en el día 10 de la lactancia por dislocación cervical y el pin al animal con su abdomen hacia arriba. </li><li> Mojar la zona ventral con etanol y secar con una toalla de papel. </li><li> Con unas pinzas, tire hacia arriba de la piel del abdomen entre las dos patas traseras y hacer una incisión (sólo a través de la piel) de aproximadamente 1 cm con tijeras afiladas. A partir de esta primera incisión, a continuación, utilizar tijeras para cortar la piel hasta el cuello en el ratón. Tire de la piel de la peritoneo y pin abajo de un lado de la piel a la vez, que se extiende enseñó. </li><li> Recoger el abdominal y las glándulas mamarias inguinales empujándolos lejos de la piel con un hisopo y finalmente tirar o de corte lejos del peritoneo. Nota: En este paso tinción Carmine se puede realizar con el fin de visualizar el epitelio mamario dentro de toda la glándula 43. Este enfoque puede ser útil para analizar la morfología global de la glándula mamaria en diversas condiciones fisiológicas (etapas de desarrollo, enfermedades, in vivo tratamientos). </li><li> Retire el ganglio linfático se encuentra en el cruce de la abdominal y las glándulas inguinales 44. </li></ol></li><li> La fijación del tejido mamario <ol><li> Cortar el tejido mamario en 3 mm 3 fragmentos con un bisturí e inmediatamente enjuagar estos fragmentos en una solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, con el fin de eliminar la mayor cantidad de leche posible. </li><li> Secar rápidamente los fragmentos en un papeltoalla y ponerlos en una solución de PBS frío que contenía 4% de paraformaldehído (PFA, HCHO, 32% de solución de formaldehído, PRECAUCIÓN) de 10 a 15 minutos en hielo. Nota: Este es el tiempo suficiente para permitir el posterior análisis en cortes de tejido mamario por IIF36 y / o hibridación in situ 45. Sin embargo, como fijadores aldehído penetran bastante lentamente en trozos de tejido (~ 1-3 mm por hora), esta vez podrá ampliarse para asegurar una fijación óptima de la muestra de tejido. Alternativamente, fijar tejidos in vivo por perfusión un animal anestesiado con una solución de fijación (no se detalla en el presente estudio). </li></ol></li><li> Infusión de sacarosa <ol><li> Rápidamente enjuagar los fragmentos mamarias en PBS frío y sumergirlos en una solución de PBS frío que contiene 40% de sacarosa (D-sacarosa, C12H22O11, Sr. 342.3 g / mol) de 16 a 48 horas a 4 ° C bajo agitación suave. </li></ol></li><li> Incrustación de tejidos Nota: En este paso, los fragmentos mamarias se puede volver a cortar a fin de que fragmentos más pequeños (2-3 mm 3) O para ajustar su forma. <ol><li> Adecuadamente etiquetar los moldes de plástico y llenar un tercio del volumen del molde con compuesto OCT, se mantiene a RT. Coloque un fragmento (2-3 mm 3) de tejido mamario por molde y cubrir con compuesto de octubre </li><li> Coloque los moldes en la superficie del nitrógeno líquido (en una hoja de aluminio o utilizando un tamiz metálico) y permitir que el producto se congele. Nota: Debe convertirse en sólido y blanco antes de sumergir el molde en nitrógeno líquido. </li></ol></li><li> Almacenar las muestras congeladas a -80 ° C hasta que se realizan cortes de tejido. </li></ol> 2. Seccionamiento tejido congelado Nota: un criostato, que es esencialmente un microtomo dentro de un congelador, se requiere para hacer cortes de tejido congelados. Una temperatura más baja se requiere a menudo para los tejidos grasos o ricos en lípidos, como la glándula mamaria virginal. <ol><li> Ajuste la temperatura del criostato a -26 ° C y espere hasta que tenga stabilizado. Mantener el bloque de tejido congelado a -26 ° C durante todo el proceso de corte. Absolutamente evitar la descongelación del tejido en cualquier momento durante el procedimiento. </li><li> Se enfría la cuchilla de afeitar, el soporte de corte, el dispositivo anti-balanceo y el cepillo a -26 ° C por su inclusión en el criostato durante al menos 10 min. También colocar una caja de portaobjetos en el interior del criostato con el fin de ser capaz de almacenar portaobjetos de vidrio como se hacen las secciones. </li><li> Adecuadamente etiquetar los portaobjetos de vidrio que se utilizan para recoger las secciones de tejido y mantenerlas a temperatura ambiente; de otro modo las secciones de tejido no se adhieren a ellos. Retire la muestra del molde dentro del criostato. Nota: El uso de láminas de vidrio con carga positiva favorecerá enormemente la adherencia de las secciones de frescos de tejido congelado debido a la mayor atracción electrostática. </li><li> Cubrir la superficie de un disco de tejido de metal con compuesto OCT (mantenida a temperatura ambiente) y empuje la muestra congelada en la misma. Coloque el montaje húmedo dentro del criostato y deje que se cool durante al menos 15 min. </li><li> Colocar la preparación en fresco en el soporte del disco del criostato. Ajuste del grosor de corte de 5-6 micras y, si es posible, use una nueva hoja afilada o al menos cambiar la zona en la hoja utilizada para cortar cada muestra ya algunos tejidos rápidamente se opaca ella. </li><li> Ajuste la posición del dispositivo anti-vuelco la hoja de afeitar, mediante cortes del medio de montaje hasta que las rodajas se forman de manera uniforme y correcta. Idealmente, el dispositivo antivuelco intervendrá sobre la hoja de afeitar en alrededor de 1 mm. </li><li> Una vez que los ajustes son correctos, realice cortes de tejido girando la rueda en un movimiento uniforme continua. A menos que la temperatura es ideal, una sección de tejido será, por naturaleza, tratar de acurrucarse. <ol><li> Use un cepillo para agarrar y maniobrar la sección por el escenario con el fin de colocarlo como desee en el portaobjetos de vidrio. Utilice el cepillo para limpiar los restos posiblemente presentes en el bloque de tejido congelado y / o la hoja de afeitar. </li></ol></li><li> Halarla sección de tejido hacia el usuario y evitar presionarla sobre la etapa de criostato. Evite presionar la sección de tejido en el escenario criostato ya que puede conducir a la adherencia de la lámina de tejido en el escenario y por lo tanto la incapacidad para recuperar con el portaobjetos de vidrio. </li><li> Recuperar secciones de tejido de uno en uno a recogerlos en la superficie de un portaobjetos de vidrio, sosteniéndolo por encima de la sección y en ángulo hacia abajo para tocar la sección de tejido. Nota: Las secciones de tejido se adhieren rápidamente al vidrio caliente debido a la atracción estática. Si varias secciones de tejido se colocan en la misma diapositiva, tenga cuidado de no solape ellos y el espacio lo suficiente como para ser capaz de encerrar de forma individual en un círculo hidrofóbica (ver sección 3.1.1.). </li></ol> 3. Inmunofluorescencia indirecta <ol><li> Localización de las secciones <ol><li> Use una barrera hidrofóbica lápiz para dibujar un círculo alrededor del tejido hidrófobo diapositivas montadas. Deje que el círculo seco durante aproximadamente 1 min a TA. Trace una línea alrededor de la tsecciones problema con un marcador permanente negro fino, así, pero en el lado de la corredera de vidrio opuesto al uno donde las secciones de tejido son. Nota: Este círculo es repelente al agua y acetona y alcohol insoluble. Por lo tanto, proporciona una barrera a soluciones acuosas utilizadas durante el procedimiento de IHC y reduce el volumen de reactivos requeridos. </li><li> Rehidrate secciones de tejido cubriéndolos con una gota de ~ 250 l de PBS durante unos pocos minutos a TA. Fijar secciones de tejido cubriéndolos con ~ 250 ml de una solución de PFA 3% recién preparado en PBS durante 10 a 15 min. Nota: De forma opcional, en este caso, utilice una solución de enfriamiento aldehído cloruro de amonio 50 mM ((NH 4 Cl, Sr. 53,5 g / mol) en PBS o glicina 0,1 M (C 2 H 5 NO 2, el Sr. 75,07 g / mol) en PBS ) para detener la reacción de fijación. Lavado simple y abundante PBS es generalmente suficiente para eliminar aldehído sin reaccionar. </li></ol></li><li> La recuperación de antígenos (opcional) <br/&gt; Nota: Aunque la mayoría de los antígenos pueden ser detectados y sin recuperación de antígeno (AR), otros serán observados sólo si se lleva a cabo este paso. En algunos casos, AR también permite la mejora de la señal observada. <ol><li> Coloque la solución AR (mM Tris 100 (C 4 H 11 NO 3, Mr 121,14) 5% de urea (NH 2 CONH 2, el Sr. 60,06) pH 9,6) en un vaso de precipitados. El volumen de solución AR debe ser suficiente para cubrir completamente los portaobjetos de vidrio colocadas en un soporte de vidrio. </li><li> Precalentar la solución AR a 95 ° C mediante el control de la temperatura con un termómetro y luego colocar los portaobjetos de vidrio en un bastidor adecuado, sumergir el bastidor en el tampón caliente, cubierta para limitar la evaporación e incubar durante 10 min a 95 ° C. </li><li> Retire el vaso de precipitados del baño de agua y dejar los portaobjetos de vidrio durante otros 10 minutos en el búfer. </li></ol></li><li> Inmunodetección <ol><li> Enjuague secciones de tejido con PBS (~ 250 l / sección) y saturar con una soluciónde 3% de albúmina de suero bovino (BSA, ~ 250 l / sección) en PBS durante al menos 30 min a TA. </li><li> Poner un 30-50 l de anticuerpo primario diluido en PBS que contenía 2% de BSA en cada sección de tejido. Nota: Este volumen es suficiente para formar una gota que cubre completamente la sección de tejido. </li><li> Coloque el mismo volumen de diluyente (2% de BSA en PBS) por sí sola en una sección de tejido para realizar un control negativo sin anticuerpo primario. <ol><li> Sistemáticamente incluir este control negativo en cada experimento IHC y llevar a cabo para cada anticuerpo secundario utilizado para estimar el fondo del experimento (etiquetado no específica debido a la secundaria de anticuerpos y / o el tejido auto-fluorescencia). Otros tipos de controles positivos o negativos también se pueden realizar para asegurar la especificidad de la etiqueta (ver discusión). </li></ol></li><li> Coloque los portaobjetos de vidrio en una caja humidificado O / N a 4 ° C. Nota: Los anticuerpos primarios utilizados fueron monoclonal de ratón anti-citoqueratina8 (CK8, dilución 1:50), monoclonal de ratón anti-citoqueratina 14 (CK14, dilución 1:50), policlonal de conejo caseína anti-ratón (# 7781, 1:50 dilución, generosamente proporcionada por MC Neville, Universidad de Colorado Health Centro de Ciencias, CO, EE.UU.), policlonal de conejo anti-btn1 (1: 300 dilución, generosamente proporcionado por IH Mather, Departamento de Ciencias Animales y aviar, de la Universidad de Maryland, College Park, MD, EE.UU.), policlonal de conejo anti-Stx6 ( dilución 1:50, generosamente proporcionado por S. Tooze, Cancer Research UK, Instituto de Investigación de Londres, Londres, Reino Unido) y conejo policlonal anti-VAMP4 (dilución 1:50). </li><li> Lávese bien las secciones de tejido con PBS al menos cuatro veces durante 10 min a RT. </li><li> Diluir el anticuerpo apropiado secundario (conjugado con rodamina de cabra anti-IgG de conejo (H + L), 1: 300 dilución) en PBS que contenía 2% de BSA, colocar el 30-50 l de esta solución en todas las secciones de tejido, y se incuba durante 1,5 hr a TA. <ol><li> Desde fluorocromos son moléculas sensibles a la luz, no lo hagasexponer las secciones de tejido a la luz hasta su análisis. Para IIF en secciones de tejido, favorecer anticuerpos secundarios acoplados a un fluoróforo rojo desde las membranas celulares tienden a generar una auto-fluorescencia verde que puede interferir con el etiquetado baja. Por otra parte, la elección de un anticuerpo secundario acoplado a fluoróforo rojo permite el etiquetado concomitante de lípidos neutros (véase más adelante). </li></ol></li><li> Lave bien las secciones de tejido con PBS por lo menos cuatro veces durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Post-fijación (opcional) <ol><li> Para algunos experimentos, realice post-fijación mediante la incubación de las muestras con 2% PFA diluidas en PBS durante 10 min a RT a fin de estabilizar los andamios de antígeno / anticuerpo. Sin embargo, este paso se puede prescindir en la mayoría de los casos. </li></ol></li><li> Lípidos neutros y counterstaining ADN <ol><li> Para visualizar CLD y MFG, color lípidos neutros mediante la incubación de las secciones de tejido en el 30-50 l de una solución de PBS que contenía 3 mg / ml de bodipy 493/ 503 durante 10 min a RT. Rápidamente enjuague secciones de tejido dos veces con PBS. </li><li> Contratinción ADN nuclear con un 30-50 l de una solución de PBS que contenía 3 mM de DAPI (4-6-diamidino-2-fenilindol, 5 mg solución madre / ml) durante 10 min a TA. Lávese las secciones de tejido dos veces con PBS antes de montar las diapositivas para la observación. </li></ol></li><li> Sección de montaje <ol><li> Retire PBS y colocar una gota de medio de montaje en cada sección de tejido. </li><li> Coloque un lado de la hoja de la cubierta en un ángulo contra la diapositiva, haciendo contacto con el borde exterior de la gota líquida y luego baje la cubierta lentamente, evitar las burbujas de aire. Deje que el líquido se extendió entre el portaobjetos y el cubreobjetos durante unos minutos y luego retirar el exceso de medio de montaje con una toalla de papel. </li><li> Sellar el cubreobjetos al portaobjetos de vidrio con secciones esmalte de uñas y tejido se almacena a 4 ° C para evitar su exposición a la luz hasta la observación. </li></ol></li></ol>4. Fluorescencia Observación y adquisición de imágenes Nota: un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara se requiere controlado por el software de adquisición de imágenes para observar los resultados de IHC. <ol><li> Antes de la adquisición de imágenes, comprobar la intensidad del etiquetado y evaluar el fondo del experimento observando los controles negativos. Adquirir imágenes de cada marcador fluorescente (canal de color) de forma individual. </li><li> Adquirir todas las imágenes, incluidas las de los controles correspondientes, en las mismas condiciones (exposición y los ajustes generales) para cada canal de color. </li><li> Microscopía convencional <ol><li> Realizar la microscopía de epifluorescencia con un microscopio equipado con filtros estándar de isotiocianato de fluoresceína (FITC, verde), rodamina (rojo) y DAPI (azul) emisiones, × 20 y × 63 (de inmersión en aceite, NA 1.3) objetivos y una cámara de imagen DP50. </li></ol></li><li> Microscopía confocal </li><li> Realizar microscopía confocal con unos microscope equipado con el software ZEN, utilizando × 20 × 63 a (aceite de inmersión, NA 1.4) los objetivos y las longitudes de onda de excitación 488- y 568 nm del láser. </li></ol> Tratamiento 5. Imagen Nota: Todas las imágenes post-tratamientos se realizaron con el software libre ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). <ol><li> Superponer imagen (fusionar) <ol><li> Abra las imágenes adquiridas en cada canal que se combinará (Archivo / Abrir). Si se trabaja con 8 bits escala de grises, color artificial atribuir a cada canal utilizando la tabla de búsqueda (Tablas de imagen / de búsqueda). </li><li> Generar la imagen compuesta a partir de imágenes en escala de grises o de color mediante el comando &quot;Combinar canales&quot; (Imagen / Color / Combinar Canales) y luego atribuir un color a cada canal. </li><li> Realice imagen apila superposición de la misma manera con la apertura de pilas adquiridos en cada canal que se combina (Archivo / Abrir) y usando el comando &quot;Combinar canales y# 8221; (Imagen / Color / Combinar Canales) atribuir un color a cada canal. Guarde la pila compuesta como una secuencia de imágenes o como una película (véase la sección 5.4). </li></ol></li><li> Imagen pila Z proyección <ol><li> Utilice la función Z proyección (Imagen / pila / Zproject, Intensidad máxima) para proporcionar una vista bidimensional de todas las imágenes de una pila de imágenes mediante la proyección a lo largo del eje perpendicular al plano de la imagen (eje z). La opción &quot;Intensidad máxima&quot; crea una imagen en la que cada píxel contiene el valor máximo sobre todas las imágenes de la pila. Esto genera una sola imagen que permite la visualización de toda la tinción observada a través de toda la pila imagen para un canal en particular o después de la superposición de varios canales. </li></ol></li><li> Imagen proyección pila 3D <ol><li> Utilice el comando de proyección en 3D (proyecto de imagen / Stack / 3D, más brillante Point, eje y) para generar una secuencia de proyecciones de un volumen de rotación sobre un plano. La representación visual de susus superficies de las estructuras internas y depende tanto del método de proyección (punto más cercano, punto más brillante (utilizado aquí), o media-valor) y los parámetros de visualización seleccionados. Cada fotograma de la secuencia de animación es el resultado de que se proyecta desde un ángulo de visión diferente. </li><li> Rotar la imagen 3D creada alrededor de cada uno de los tres ejes ortogonales (el eje y se ha seleccionado aquí). Guarde la secuencia producida como una sola imagen o una película. </li></ol></li><li> Pila de imagen para la conversión de la película <ol><li> Abra una pila de imágenes (Archivo / Abrir) y guardarlo como una película en formato .AVI con el comando &quot;AVI&quot; (Archivo / Guardar como / AVI). </li></ol></li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

IHC es un método experimental relativamente simple y directo para localizar el antígeno en secciones de tejido, que depende principalmente de las interacciones específicas de epítopo de anticuerpos. Aunque un gran número de protocolos se utilizan para localizar una proteína por IIF, el núcleo de estos procedimientos es casi siempre el mismo. Sin embargo, hay algunos aspectos críticos que pueden influir fuertemente el resultado y por lo tanto deben ser optimizados para cada estudio individual IHC. El aspecto más...

La glándula mamaria es un órgano exocrino mamíferos atípica cuya función principal es producir leche para alimentar a los recién nacidos. El desarrollo del tejido mamario se produce principalmente después del nacimiento y se caracteriza por un proceso único en el que el epitelio invade el estroma circundante. Este tejido sufre muchos cambios (crecimiento, diferenciación y regresión), especialmente durante la vida adulta, de forma concomitante con las variaciones en el estado reproductivo (Figura 1). Además de la morfología general de los tejidos, las proporciones de diferentes tipos de células, así como su disposición dentro de la glándula mamaria cambian dramáticamente durante el desarrollo 1-5. Durante la vida embrionaria, el epitelio mamario se deriva de las líneas de leche mamarias, que se define por un ligero engrosamiento y la estratificación del ectodermo, entre las extremidades delanteras y traseras a cada lado de la línea media alrededor de día embrionario 10,5 (E10.5) (Figura 1A ).En E11.5, la línea de leche se rompe en placodas individuales, que están simétricamente colocadas a lo largo de la línea de leche mamaria en lugares reproducibles, y el mesénquima que rodea comienza a condensarse. Los placodas comienzan a hundirse más profundamente en la dermis y el mesénquima mamaria organiza en capas concéntricas alrededor de la yema mamaria (E12.5-E14.5). A partir de E15.5, el epitelio mamario, comienza a proliferar y alargadas para formar el brote primario que empuja a través del mesénquima mamaria hacia la almohadilla de grasa. El brote primario desarrolla un lumen hueco con una abertura en la piel, caracterizada por la formación de la vaina pezón. En E18.5, el conducto alargando ha crecido hasta convertirse en la almohadilla de grasa y se ha ramificado en un pequeño sistema ductal arborized englobado en la almohadilla de grasa. El desarrollo es esencialmente detenido y la glándula mamaria sigue siendo rudimentaria morfogenéticamente reposo hasta la pubertad. En el embrión masculino, la activación de los receptores de andrógenos conduce a la degeneración de los brotes, que desaparecenpor E15.5. A partir de E18, desarrollo mamario cesa hasta la pubertad 6-9. Al nacer, la glándula mamaria alberga un sistema ductal rudimentaria que se alarga y las ramas lentamente (crecimiento isométrico). En el inicio de la pubertad, estructuras esféricas situadas en las puntas de los conductos llamados los brotes extremas terminales (TEBs), están formados por una capa exterior de las células gorra y un núcleo interior de varias capas de células (células del cuerpo). Estas estructuras son altamente proliferativa y se infiltran en el tejido estromal que rodea en respuesta a señales hormonales. Proliferación dentro de los resultados TEBs en el alargamiento ductal, junto con la morfogénesis de ramificación. Este proceso conduce a la creación de una red arborized epitelial básica que emana de la boquilla (Figura 1B, la pubertad). En ~ 10-12 semanas después del nacimiento, cuando el epitelio ha invadido toda la almohadilla de grasa, su expansión se detiene y desaparece la TEBs. Desarrollo ductal entonces sufre cambios dinámicos, es decir, successive la proliferación y la regresión de las células epiteliales de acuerdo con los ciclos de estro 10 (Figura 1B, adulto). Desde el inicio de la gestación, el tejido mamario se somete a un crecimiento importante y cambios morfológicos para prepararse para la lactancia. El epitelio mamario ampliamente proliferar y diferenciarse, lo que lleva a una red túbulo-alveolar altamente ramificado. Al mismo tiempo, las células epiteliales mamarias (MEC) se polarizan y capaz de sintetizar y secretar productos lácteos. MECs se organizan en numerosas estructuras alveolares (acinos) que están rodeados por las células mioepiteliales contráctiles e incorporados en un estroma compuesto por tejido conectivo y adiposo, vasos sanguíneos y terminaciones nerviosas (Figura 1B, embarazo). Además, el lado basal de MECs está en estrecho contacto con la membrana basal (matriz extracelular), y las interacciones entre estas dos entidades fuertemente regular tanto la morfogénesis y la secretora función de la mamary epitelio 11-13. Todos estos procesos se basan en la acción de diversas señales ambientales, de los cuales los más importantes son hormones14, factores paracrinos y la matriz extracelular. Por ejemplo, la progesterona induce extensa 15 y alveologenesis que, en combinación con la prolactina (PRL) de ramificación lateral 16,17, promueve y mantiene la diferenciación de los alvéolos. Además de los esteroides y PRL18, citoquinas y vías de señalización asociadas con el desarrollo (Wnt y Notch vías de señalización) también están involucrados en el compromiso de linaje mamaria y el desarrollo 19 a 21. Al final del embarazo, las MECs luminales comienzan a producir una leche rica en proteínas conocida como calostro en el lumen de los alvéolos. Además, la progesterona actúa sobre la permeabilidad epitelial y desde las uniones estrechas están todavía abiertos, el calostro también se encuentra en la corriente de la sangre materna. Después del parto, la Mammary epitelio ocupa casi todo el volumen de la glándula mamaria y está altamente organizada (Figura 2, el epitelio mamario). Unidades productoras de leche, es decir, los alvéolos (Figura 2, alveolus), están formados por una monocapa de células secretoras mamarias epiteliales polarizadas (mESCs), con su membrana plasmática apical delimita el lumen. Los alvéolos se disponen en lóbulos que se agrupan en lóbulos conectados a conductos que drenan la leche al medio exterior (Figura 2, lóbulo). Lactancia ocurre, es decir., MESCs comienzan a secretar cantidades abundantes de leche, provocadas principalmente por la caída de las hormonas placentarias (principalmente progesterona) (Figura 1B, la lactancia). Genes de la proteína de la leche se activan en un curso de tiempo temporal definido que van desde el embarazo hasta la lactancia 9,22,23, principalmente en respuesta a PRL pituitaria lanzado en el momento de la succión. Al mismo tiempo, los contactos entre mESCs y la matriz extracelular tanto estimulan la leche proteína syntHESIS a través de señales que están mediadas a través de las interacciones entre las integrinas celulares y laminina 24,25, y suprimen la apoptosis en mESCs 26,27. Estas vías de señalización conducen a la activación de la proteína de la leche promotores de genes 28 a través de la activación de la transcripción factores específicos 29. Contactos célula-célula también son importantes para algunos aspectos de la diferenciación entre ellos el establecimiento de la polaridad apical y la secreción vectorial de los productos lácteos. Las uniones estrechas rápidamente cerca después del comienzo de la lactancia y mESCs finamente orquestan la absorción de moléculas de la sangre, así como la síntesis, transporte y secreción de componentes de la leche, en respuesta a las necesidades nutricionales de los recién nacidos. En el momento de la succión, la contracción de las células mioepiteliales que rodean los alvéolos se produce en respuesta a la oxitocina y conduce a la eyección de la leche a través de los conductos y en el pezón. La leche es un fluido complejo que contiene proteínas (principalmentecaseínas), azúcares (principalmente lactosa), lípidos y minerales, así como moléculas bioactivas, tales como inmunoglobulinas A (IgA), factores de crecimiento y hormonas. Las caseínas son sintetizados, ensamblado en estructuras supramoleculares, es decir, micelas de caseína, que se transportan a lo largo de la ruta secretora, y luego liberados por exocitosis, es decir, la fusión de vesículas secretoras que contienen caseína (SV) con la membrana plasmática apical de MESC (Figura 2). El tráfico intracelular se basa en el intercambio de material entre compartimentos membranosos e implica soluble N-etilmaleimida-Sensible Fusion (NSF) Fijación de proteínas (SNAP) Receptor (SNARE) 30,31. La familia de proteínas SNARE se subdivide en trampas vesiculares (v-SNAREs), presentes en la membrana de la vesícula, y trampas objetivo (t-SNAREs), localizadas en las membranas de destino. Por comprimir a través de sus dominios de doble arrollamiento, V y T-SNAREs ensamblan para formar una gran estabilidad complejo haz de cuatro hélices, conocidos como XXcomplejo SNARE e. Este complejo promueve la fusión de dos bicapas lipídicas opuestas llevando gradualmente en estrecha proximidad 30,32. Después, complejos SNARE se disocian por la adenosintrifosfatasa NSF y sus proteínas adaptador de proteínas SNAP y SNARE se reciclan de nuevo a su compartimento de origen 33. Curiosamente, cada proteína SNARE reside predominantemente en compartimentos celulares distintos y SNARE emparejamiento puede contribuir a la especificidad de los eventos de fusión intracelulares 34. Estudios previos sugieren que al menos proteína 23 (SNAP23) y asociada a vesículas de membrana de proteínas 8 (VAMP8) y syntaxins (STX) sinaptosomal asociada -7 y -12 juegan un papel en la caseína exocitosis 35,36. Estas proteínas también se han encontrado en asociación con la fracción lipídica de la leche, es decir, la grasa de la leche glóbulos (MFG) 37. El modelo imperante actual postula que las gotas de lípidos citoplasmáticos (CLD) se forman por la acumulación de l neutralipids (principalmente triglicéridos y ésteres de esterol) y el colesterol derivado de la dieta materna entre las dos valvas de la membrana 38 a 41 retículo endoplasmático (ER). Grandes CLD se forman, al menos en parte, por la fusión de CLD más pequeños mientras son transportados a la parte apical de mESCs donde son liberados como MFG (1-10 micras de diámetro) por gemación, siendo envuelto por la membrana plasmática apical MESC 40-42. Lactancia cesa después cachorros son destetados y los mESCs mueren progresivamente por apoptosis, lo que lleva a la regresión del tejido mamario de nuevo a un estado puberal (Figura 1B, la involución). La inmunofluorescencia (IF) es un método de laboratorio de análisis común que se utiliza en casi todos los aspectos de la biología, tanto en investigación como en el diagnóstico clínico. SI técnicas se pueden realizar en las secciones de tejidos (inmunohistoquímica, IHC) o celulares (inmunocitoquímica, ICC) muestras. Este enfoque poderoso basa en el uso de fluorescent-anticuerpos marcados que se unen específicamente (directa o indirectamente) para el antígeno de interés, permitiendo así la visualización de su distribución tejido a través de microscopía de fluorescencia. Las señales de fluorescencia dependen principalmente de la calidad y la concentración de los anticuerpos y el manejo adecuado de la muestra. Un protocolo simple de inmunofluorescencia indirecta (IFI) se presenta para detectar los productos lácteos (caseínas y MFG) y proteínas implicadas en la secreción de producto lácteo (butyrophilin (btn1), proteínas SNARE) en secciones congeladas de tejido mamario de ratón (Figura 3). Aunque este protocolo proporciona una visión completa de IHC, que van desde la recogida de tejidos a la imagen post-tratamiento, crítica y pasos opcionales, así como algunas recomendaciones técnicas también son presentados y discutidos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:756px;" width="755">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Dissection</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:236px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Pins</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ethanol</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Scissors</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel and adapted blades</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ice</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Towel paper</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Tissue sample preparation</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Phosphate Buffered Saline (pH7.4)</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>P-3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml)</td>
			<td style="width:155px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td>personnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT compound/Tissue Tek</td>
			<td style="width:155px;">Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose (D-saccharose)</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>27480.294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Plastic molds</td>
			<td style="width:155px;">Dominique Dutscher</td>
			<td>39910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Cryostat/sample support</td>
			<td style="width:155px;">Leica&#160;</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Razor blades (SEC35)</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>152200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Slide box</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra Plus</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>10143560W90/1014356190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Brushes</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">IHC</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Super Pap Pen</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Permanent marker (black)</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:239px;">50 mM NH4Cl in PBS</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>A-0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">0.1 M glycine in PBS</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>24403.367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Heater (up to 100&#176;C)</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPI</td>
			<td style="width:155px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000/H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade)</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>CORN2980-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Nail polish</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:239px;">Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences 
			Center, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Biolegend (Covance)</td>
			<td>MMS-162P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>MS-115-P0/P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:239px;">Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:239px;">Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted S. Tooze 
			(Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td>ab3348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;">Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-025-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Counterstains</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Bodipy 493/503</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>D-3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>D-1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Observation/Image capture</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:239px;">conventional fluorescence microscope</td>
			<td style="width:155px;">Leica Leitz DMRB 
			microscope</td>
			<td></td>
			<td style="width:236px;">Standard filters for FITC, Rhodamine 
			and DAPI emissions,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#215;63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), Cell&#710;F software (Olympus)</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:239px;">Laser Scanning Microscope (confocal microscopy)</td>
			<td style="width:155px;">Zeiss LSM 
			510 microscope</td>
			<td></td>
			<td style="width:236px;">Plan-Apochromat &#215;63 oil-immersion objective (NA 1.4),&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; CLSM 510 software,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Image treatment</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ 1.49k software</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td>Free software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland

La inmunofluorescencia indirecta se utiliza para detectar y localizar proteínas de interés en un tejido. El protocolo que se presenta aquí describe un método completo y sencillo para la detección inmunológica de las proteínas, el ratón glándula mamaria lactante ser tomado como un ejemplo. Un protocolo para la preparación de las muestras de tejido, especialmente en relación con la disección de glándula mamaria de ratón, la fijación del tejido y de corte de tejido congelado, son detallada. Un protocolo estándar para realizar inmunofluorescencia indirecta, incluyendo una etapa de recuperación de antígeno opcional, también se presenta. La observación de las secciones de tejido marcados así como la adquisición de imagen y post-tratamientos también se indican. Este procedimiento da una visión completa, de la colección de tejido animal a la localización celular de una proteína. Aunque este método general se puede aplicar a otras muestras de tejido, debe ser adaptado a cada tejido / primaria pareja anticuerpo estudiado.

La glándula mamaria es una glándula subcutánea situado a lo largo de la estructura ventral tanto del tórax y el abdomen en los roedores. La ubicación de los cinco pares de glándulas del ratón durante la gestación se muestra en la Figura 4. La morfología de la glándula mamaria cambia dramáticamente durante su desarrollo, lo que refleja modificaciones funcionales necesarias para prepararse para la plena lactancia (Figura 1B). En los animales vírge...

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Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

El protocolo de inmunofluorescencia indirecta descrito en este artículo permite la detección y la localización de las proteínas en la glándula mamaria del ratón. Un método completo se da para preparar muestras de glándula mamaria, para llevar a cabo la inmunohistoquímica, a la imagen las secciones de tejido mediante microscopía de fluorescencia, y para reconstruir imágenes.

Inmunofluorescencia indirecta en secciones congeladas de ratón Glándula Mamaria

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

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Research

JoVE Journal

Biology

36.7K vistas.  INRA.  El protocolo de inmunofluorescencia indirecta descrito en este artículo permite la detección y la localización de las proteínas en la glándula mamaria del ratón. Un método completo se da para preparar muestras de glándula mamaria, para llevar a cabo la inmunohistoquímica, a la imagen las secciones de tejido mediante microscopía de fluorescencia, y para reconstruir imágenes. 

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Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

Inmunohistoquímica en secciones de parafina de la epidermis del ratón Utilizando anticuerpos fluorescentes

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Investigación

Biología

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Células epiteliales mamarias de ratón forma Mammospheres durante la diferenciación lactogénica

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

Procedimiento de mama epiteliales de Trasplantes

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

Los cambios en la morfología de la glándula mamaria y el riesgo de cáncer de mama en ratas

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Las secciones incluidas en parafina y congeladas de Drosophila Los músculos de Adultos

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

Aislamiento de células de la glándula salival del ratón madre

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Evaluación de la glándula mamaria de desarrollo y función en modelos de ratón

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Perfiles de transcripción de los organismos unicelulares de los cardiomiocitos de ratón adulto

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

Inyección intraductal de entrega de la droga localizada a la glándula mamaria de ratón

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and activating sperm, the components in the seminal fluid can also influence female physiology to augment fertilization success of the sperm donor. While many studies have reported such effects in species with separate sexes, few studies have addressed this in simultaneously hermaphroditic animals. This video protocol presents a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using a simultaneously hermaphroditic freshwater snail, the great pond snail Lymnaea stagnalis, as model organism. While the procedure is shown using complete prostate gland extracts, individual components (i.e., proteins, peptides, and other compounds) of the seminal fluid can be tested in the same way. Effects of the receipt of ejaculate components on egg laying can be quantified in terms of frequency of egg laying and more subtle estimates of female reproductive performance such as egg numbers within each egg masses. Results show that seminal fluid proteins affect female reproductive output in this simultaneous hermaphrodite, highlighting their importance for sexual selection.

This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Efecto de la Mujer Accesorios Glándula productos en la puesta de huevos en gasterópodos

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...