Como los FAPs son mediadores de la regeneración muscular y la fibrosis patológica, nuestro protocolo permite la caracterización de la dinámica de faP post lesión muscular y el aislamiento de FAPs para estudios in vitro o ex vivo. Hasta la fecha, los estudios se han realizado exclusivamente en FAPs aislados de ratones. Nuestro protocolo permite el aislamiento efectivo de los FAPs de la rata más grande, proporcionando una disponibilidad de tejido mucho mayor para los ensayos posteriores.
El tiempo prolongado de procesamiento de tejidos puede afectar negativamente la viabilidad de los FAP. Si se procesan varias muestras simultáneamente, se recomienda que dos operadores realicen el protocolo en conjunto para maximizar la viabilidad de las células aisladas. Comience colocando el tejido muscular cosechado en un plato de cultivo celular estéril de 10 centímetros.
Rasgue suavemente y pica el tejido con fórceps y retire el tejido conectivo para obtener aproximadamente tres a cuatro milímetros de piezas en cubos. Transfiera el tejido minster a un tubo cónico estéril de 50 mililitros que contenga seis mililitros de DMEM y 1% de penicilina-estreptomicina. A continuación, active 365 microlitros de solución de colagenasa II agregando 10 microlitros de solución de cloruro de calcio 300 milimolar.
Añadir la solución de colagenasa II activada a la suspensión tisular para una concentración final de 250 unidades por mililitro. Incubar los tubos en un agitador durante una hora y a 37 grados centígrados a 240 x g con agitación manual cada 15 minutos para desalojar el tejido adherido al lado del tubo. Después de una hora de incubación, agregue 100 microlitros de colagenasa II y 50 microlitros de dispasa a la muestra.
Luego, muestree de 15 a 20 veces con una pipeta serológica hasta que la solución sea homogénea. Incubar la muestra de nuevo durante 30 minutos a 37 grados centígrados y 240 x g con agitación manual cada 15 minutos. Corte lentamente las muestras de solución muscular a través de una jeringa de 20 mililitros con una aguja de calibre 20 durante 10 ciclos.
Luego, coloque un colador de células de 40 micras en un tubo cónico estéril de 50 mililitros y moje mediante pipeteo de cinco mililitros de DMEM suplementado con 10% FBS y 1% de penicilina-estreptomicina. Pipetear la muestra un mililitro a la vez a través del colador. Una vez filtrada toda la muestra, lave el colador celular con DMEM suplementado con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina para llevar el volumen total de la muestra a 25 mililitros.
Divida el volumen de la muestra por igual en dos tubos cónicos de 15 mililitros y centrífuga a 15 grados centígrados, 400 x g durante 15 minutos. Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y resuspenda el pellet en un mililitro de tampón de lisis de glóbulos rojos a temperatura ambiente durante siete minutos. Luego, agregue nueve mililitros de tampón de lavado para llevar el volumen a 10 mililitros y centrífuga a 15 grados Celsius, 400 x g durante 15 minutos.
Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón de lavado. Transfiera un volumen apropiado de células a un tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mililitros y mézclelo con tinte azul tripano. Cuente las células vivas en un microscopio de luz utilizando un hemocitómetro.
Para la citometría de flujo, transfiera de uno a 2 millones de células por muestra experimental a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros. Lleve el volumen de la muestra a un mililitro con tampón de lavado y coloque el tubo sobre hielo. Configure todos los controles para el experimento.
Para los controles celulares, alícuota de 500, 000 a 1 millón de células en un mililitro de tampón de lavado en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros y colóquelo en hielo. Si el experimento se realiza por primera vez, también se deben incluir suspensiones celulares de una sola teñida. Para configurar los controles de cuentas, agregue alrededor de 150, 000 cuentas de compensación positiva a cada tubo de centrífuga de 1.5 mililitros etiquetado.
Prepare el control de viabilidad transfiriendo la mitad del volumen celular del tubo de viabilidad para actualizar el tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros etiquetado como muerto. Incubar el tubo muerto a 65 grados centígrados durante dos o tres minutos, luego colocarlo en hielo. Después de la incubación, devuelva las células muertas al tubo de viabilidad.
Centrifugar las suspensiones unicelulares, incluyendo muestras experimentales y de control a 500 x g y cuatro grados Centígrados durante cinco minutos, y resuspendir los gránulos celulares en 100 microlitros de tampón de lavado después de aspirar el sobrenadante. Agregue anticuerpos de acuerdo con la condición de control o experimental, y mueva suavemente la muestra para garantizar una mezcla completa. Luego, incube en hielo en la oscuridad durante 15 minutos.
Para las perlas de compensación, incube el tubo a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 minutos. Lleve el volumen de cada muestra a un mililitro agregando 900 microlitros de tampón de lavado a la suspensión de una sola celda, y 900 microlitros de PBS para controles de perlas de compensación. Centrifugar suspensiones unicelulares a 500 x g y cuatro grados Celsius durante cinco minutos, y controles de perlas de compensación a 300 x g y cuatro grados Celsius durante cinco minutos.
Después de la centrifugación de las muestras, aspire el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en 300 microlitros de tampón de lavado, y controles de perlas en 300 microlitros de PBS y 150, 000 perlas de compensación negativa. Mantenga las muestras de células en hielo y muestras de cuentas a temperatura ambiente bajo papel de aluminio. Proceder con la adquisición de citometría de flujo estableciendo la estrategia de gating para identificar progenitores fibro-adipogénicos y progenitores miogénicos.
En el análisis representativo, se confirmó la conjugación exitosa del anticuerpo SCA-1 APC con tinción única de perlas de compensación y suspensiones celulares generadas a partir del músculo gastrocnemio de rata sana. Se titularon cinco concentraciones diferentes de Sca-1 APC en suspensiones unicelulares, y se identificó la concentración óptima de anticuerpos en función de la mayor intensidad de fluorescencia con una tinción de fondo mínima. Las identificaciones citométricas de flujo de FAPs y MPs en gastrocnemio de rata se realizaron utilizando la estrategia de gating que se muestra aquí.
Las muestras se cerraron primero para excluir los escombros en el conteo de cuentas. Las celdas se cerraron para excluir los dobletes por las características de dispersión frontal y dispersión lateral. La viabilidad de las células resultantes se evaluó mediante tinción con SYTOX Blue.
Los singletes negativos de SYTOX Blue se evaluaron para CD31 y CD45 para excluir las fracciones Lin+. Se evaluó la población Lin. Las células que fueron positivas únicas para Sca-1 fueron designadas FAPs, y las células que fueron positivas únicas para VCAM-1 fueron designadas MP.
Con la coinmunotinción inmediatamente después de la clasificación, la población recién aislada de FAPs mostró una tinción positiva para PDGFRalpha sin contaminación por células Pax7 positivas. Por el contrario, la población clasificada de parlamentarios se tiñó de positivo para Pax7 con una ausencia de células PDGFRalpha-positivas. Los FAPs demostraron fibroblastos y adipocitos diferenciados en el día 12 en medios de diferenciación adipogénica con expresión de proteína 1 específica de fibroblastos y perilipina 1, respectivamente.
La presencia de triglicéridos neutros y lípidos de adipocitos maduros fue evidente con la tinción oil red O. Además, los FAPs demostraron una presencia de colágeno tipo I y una ausencia de miocitos contaminantes. Los MP cultivados en medios de diferenciación miogénica en el día 12 mostraron la presencia de miocitos maduros y miotubos multinucleados fusionados, y estaban libres de fibroblastos y contaminación de adipocitos.
Al utilizar esta técnica para aislar células vivas para cultivos a largo plazo, los investigadores deben asegurarse de utilizar la técnica aséptica y, al mismo tiempo, trabajar de manera eficiente para garantizar una buena viabilidad celular.
