Este protocolo se puede utilizar para responder a la pregunta de si y cómo la fracturación hidráulica afecta a las bacterias en los arroyos cercanos y, por extensión, a los propios arroyos. La principal ventaja de esta técnica es su naturaleza holística, ya que lleva al investigador desde la recolección de muestras hasta el análisis de datos. Demostrando el procedimiento estará Jeremy Chansee, un bioinformático en mi laboratorio, Sydney Regal, un estudiante de pregrado en Juniata College, y Gillian Leister, mi gerente de laboratorio.
Para recolectar muestras de sedimentos para la extracción de ácido nucleico, use guantes para sumergir un tubo cónico estéril de 50 mililitros tapado en el agua del arroyo desde la orilla. Mientras el tubo está sumergido, retire la tapa y use la tapa para recoger aproximadamente tres mililitros de sedimento de una profundidad de uno a tres centímetros en el tubo. Después de recolectar la muestra, vierta todo menos aproximadamente un mililitro de agua fuera del tubo y use una pipeta de 1, 000 microlitros para agregar tres mililitros de conservante de ADN / ARN a la muestra.
Gire el tubo cónico tapado durante cinco segundos para mezclar bien el conservante y la muestra y almacenar la muestra en hielo. Al regresar al laboratorio, guarde la muestra a menos 20 grados Celsius para el análisis de ADN 16S o menos 70 grados Celsius para el análisis de ARN metatranscriptómico. Para la recolección del filtro, llene y vacíe completamente una botella estéril de un litro con agua corriente tres veces para acondicionar la botella antes de llenar la botella una última vez.
En una superficie estable, extraiga un volumen completo de agua de corriente en una jeringa de bloqueo luer estéril y conecte la jeringa a un filtro de polietersulfona estéril y libre de ADN / ARN de 1,7 centímetros de diámetro con un tamaño de poro de 0,22 micras. Enjuague todo el volumen de agua de la corriente a través del filtro. Cuando todo el volumen de la muestra se haya filtrado de la misma manera, extraiga aproximadamente 20 mililitros de aire en la jeringa y empuje el aire a través del filtro para eliminar el exceso de agua del filtro.
A continuación, use una micropipeta P1000 para agregar dos mililitros de conservante de ADN / ARN a la abertura más grande del filtro mientras mantiene el filtro horizontalmente con la punta de la pipeta en el barril del filtro para asegurarse de que el conservante ingrese al filtro. Luego selle el filtro con cuadrados bien envueltos de película de parafina alrededor de cada abertura y coloque el filtro en una bolsa de muestra estéril sobre hielo. Al regresar del muestreo, almacene los filtros para 16S o para el análisis metatranscriptómico como se demuestra.
Antes de comenzar una transferencia de muestra, limpie el área de trabajo con 10% de lejía y 70% de etanol. Para la extracción de ácido nucleico de una muestra de sedimento, use una herramienta de metal esterilizada con llama y etanol para transferir aproximadamente 250 miligramos de muestra a un tubo de microcentrífuga. Para la extracción de ácido nucleico de una muestra de filtro, use un agarre de vicio esterilizado con etanol y llama al 70% para abrir la carcasa del filtro en la superficie estéril y quitar el núcleo de la carcasa.
Use un bisturí estéril para cortar en la parte superior, inferior y a lo largo de la costura del núcleo y use pinzas estériles para doblar el papel de filtro antes de cortarlo en trozos pequeños con el bisturí. Luego, coloque cuidadosamente las piezas del filtro en un tubo de microcentrífuga sin entrar en contacto con ninguna superficie no esterilizada. Para la lisis de las células dentro de cualquier tipo de muestra, someta el tubo a un disruptor celular a alta velocidad.
Después de al menos cinco minutos, centrífuga las muestras y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga estéril. Agregue el tampón de lisis al sobrenadante en una proporción de uno a uno y transfiera la solución al filtro provisto. Coloque el filtro en un nuevo tubo de microcentrífuga y agregue 400 microlitros de tampón de preparación al tubo.
Después de la centrifugación, agregue 700 microlitros de tampón de lavado al tubo y centrífuga el filtro nuevamente. Después de desechar el flujo, agregue 400 microlitros de tampón de lavado al tubo para una centrifugación adicional y transfiera el filtro a un nuevo tubo de microcentrífuga estéril. Para eludir el ADN, trate el filtro con 50 microlitros de agua libre de DNasa/RNasa durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Mientras tanto, coloque un filtro de tres HRC en un tubo de recolección y agregue 600 microlitros de solución de preparación de HRC. Después de la centrifugación, transfiera el filtro a un nuevo tubo de microcentrífuga estéril y transfiera el ADN eluido al filtro para la centrifugación. El flujo a través contiene el ADN extraído.
Para crear una biblioteca de ARN DNA 16S, primero use el producto de ADN recién extraído para la amplificación de ARN ribosómico 16S con un protocolo de PCR estándar. Mezcle siete microlitros del producto de PCR resultante y 13 microlitros de agua sin DNasa y cargue la solución de PCR en un gel de agarosa al 2%. Luego ejecute el gel a 90 voltios durante 60 a 90 minutos para verificar un tamaño de banda de 386 pares de bases como evidencia de una amplificación exitosa.
Para purificar la biblioteca de ARN ribosómico DNA 16S, auna 10 microlitros de los productos de PCR que produjeron bandas brillantes y 13 microlitros de las muestras que produjeron bandas débiles en un tubo de microcentrífuga estéril y carga alrededor de 150 a 200 nanogramos de cada muestra agrupada en pozos individuales de un nuevo gel al 2%. Después de ejecutar el gel como se ha demostrado, elimine las bandas de 386 pares de bases del gel y use un kit comercial para purificar el ADN. Luego elute el ADN purificado con 30 microlitros de clorhidrato Tris milimolar de 10 milimolares y empaquete las bibliotecas purificadas en hielo seco antes de enviarlo para la secuenciación de próxima generación.
En este análisis representativo, todas las extracciones, excepto una, se denominarían exitosas. Las bandas brillantes observadas después de la amplificación por PCR indican el éxito del protocolo 16S. Las muestras 16S deben tener un mínimo de 1,000 secuencias con al menos 5, 000 siendo ideales, mientras que las muestras metatranscriptsómicas deben tener un mínimo de 500, 000 secuencias con al menos 2 millones siendo ideales.
Se muestran muestras de sedimentos de 21 sitios diferentes en 13 corrientes diferentes para 16S y análisis metatranscriptómicos. De esos 21 sitios, 12 estaban aguas abajo de la actividad de fracking y clasificados como fracturación hidráulica positiva, y nueve estaban aguas arriba de la actividad de fracking o en una cuenca en la que el fracking estaba ausente y clasificado como fracturación hidráulica negativa. Según lo evaluado por el análisis de PERMANOVA, la separación observada entre los datos positivos y negativos de fracturación hidráulica sugiere que las muestras positivas de fracturación hidráulica se vieron afectadas por el fracking.
Los predictores aleatorios de bosques más importantes revelarían qué características eran más esenciales para diferenciar correctamente las muestras. Si un taxón es identificado como importante por el modelo de bosque aleatorio, su perfil de resistencia antimicrobiana en muestras positivas de fracturación hidráulica podría compararse con su perfil en muestras negativas de fracturación hidráulica. Si difieren mucho, eso podría sugerir que el fluido de fracking que contiene biocidas ingresó a la corriente.
Los microbios están en todas partes, por lo que la contaminación es un problema potencial significativo con este tipo de trabajo. Los pasos iniciales de transferencia de muestras son especialmente propensos a esto. Si uno está interesado en la biodegradación microbiana u otros metabolismos, la secuenciación de escopeta de ARN se puede utilizar para investigar la expresión génica microbiana activa.
Esta técnica permite la estandarización de técnicas moleculares para la investigación de comunidades bacterianas in situ, así como análisis bioinformáticos de datos de secuencias bacterianas.
