La hipoxia es un impulsor clave del desarrollo del cáncer que induce inestabilidad genómica y tumorigénesis. Se demuestra un método para generar hipoxia central en un cáncer sólido in vitro basado en tecnología de bioimpresión 3D. Utilizando este método, se puede reproducir un gradiente hipóxico de radio utilizando una estrategia simple que combina una barrera permeable al gas impresa en 3D y una cubierta de vidrio.
Esta tecnología hipóxica del cáncer en una viruta se puede utilizar para predecir eficacia de la droga para facilitar la prescripción específica de la droga anticáncer paciente. Y también se espera que permita un diagnóstico rápido de cánceres agresivos. Para ayudar en la preparación de una solución de pre-gel de colágeno neutralizado de tres mililitros, corte las esponjas de colágeno de 30 miligramos en piezas cuadradas de cinco por cinco milímetros.
Coloque las piezas en un vial de vidrio estéril de 10 mililitros y agregue 2.4 mililitros de filtro de jeringa de 0.2 micras 0.1 ácido clorhídrico normal al vial para una incubación de tres días a cuatro grados Celsius y 15 revoluciones por minuto. Después de la digestión, colar cualquier partícula de colágeno no didigida a través de un colador de células de 40 micras y almacenar la solución de colágeno ácido a cuatro grados centígrados durante un hasta siete días. Para ajustar el pH de la solución de pre-gel de colágeno neutralizado al 1%, añadir 30 microlitros de solución de rojo fenol a una concentración final del 1% y 300 microlitros de PBS 10X a una concentración final del 10% Después de mezclar y centrifugar, utilizar un hidróxido de sodio normal para neutralizar el pH a siete, verificando el cambio de color y añadir agua destilada para obtener un volumen total de tres mililitros.
Luego guarde la solución de pre-gel de colágeno neutralizado al 1% ajustada al pH a cuatro grados Centígrados para su uso dentro de los tres días. Para comprobar previamente la gelificación de la solución pre-gel de colágeno neutralizado, use una pipeta de desplazamiento positivo para agregar 50 microlitros de gotitas de colágeno a un plato pequeño e incube las gotitas en una incubadora de 37 grados Celsius durante una hora. Al final de la incubación, compruebe si el colágeno ha cambiado de un color transparente a un blanco opaco.
Incline el recipiente para confirmar que el colágeno se adhiere a la parte inferior del recipiente. Y vierta PBS en la gota para confirmar que la construcción de colágeno no se rompe en solución. Para la impresión 3D de un molde PEVA de sacrificio, haga clic en Archivo y guarde el tipo de archivo como STL para convertir el archivo CAD 3D en un archivo STL y haga clic en Opción y formulario de salida como ASCII para generar el código G.
Para importar el archivo STL generado, haga clic en Archivo y abra el archivo STL y seleccione el archivo STL guardado. Para generar automáticamente el código G del molde PEVA de sacrificio, seleccione el modelo de rebanada del intercambiador STL-CAD. Luego, para generar rutas de impresión para la fabricación de virutas, utilice una boquilla de precisión de calibre 50 a una presión neumática de 500 kilopascales a 110 grados Celsius para imprimir el molde de PEVA de sacrificio en un portaobjetos de histología hidrofílica adhesivo estéril.
Para fundir la barrera PDMS, mezcle seis mililitros de elastómero base PDMS y 600 microlitros de agente de curado durante cinco minutos en un depósito de plástico y cargue la solución mezclada homogéneamente en una jeringa desechable de 10 mililitros. Equipó la jeringa con una punta de dispensación cónica de plástico calibre 20 y llene el molde de PEVA de sacrificio con la solución pdms mezclada. El PDMS mezclado llenará este molde de PEVA de sacrificio con una superficie convexa y la barrera será más alta que la del molde.
Después de curar la barrera PDMS en un horno de 40 grados Celsius durante más de 36 horas para evitar la fusión del PEVA, use un par de pinzas de precisión para separar el molde de PEVA de sacrificio y esterilizar la barrera permeable al gas a 120 grados Celsius en un autoclave. Para mezclar la solución con células cancerosas, resuspend cada tipo de pellet de células recolectadas en 20 microlitros de medio de cultivo y agregue un mililitro de solución pre-gel de colágeno neutralizado al 1% en cada una de las suspensiones celulares resuspended en hielo húmedo con mezcla suave. Utilice una pipeta de desplazamiento positivo para mezclar cada suspensión celular.
Cuando se obtienen soluciones homogéneas, utilice una pipeta desechable positiva para transferir los bioinks de colágeno encapsulados en células en jeringas desechables individuales de tres mililitros y almacene las jeringas a cuatro grados Centígrados hasta la impresión celular 3D. Para la impresión 3D de anillos concéntricos de cáncer-estroma, convierta el archivo CAD 3D apropiado en un formato de archivo STL y utilice un intercambiador STL-CAD para generar un código G de los anillos concéntricos de cáncer-estroma. Cargue los bioinks de colágeno encapsulados en la célula en el cabezal de la impresora 3D y ajuste la temperatura del cabezal y la placa a 15 grados centígrados.
Cargue la ruta de impresión generada en el software de control de la impresora 3D y haga clic en Iniciar para imprimir los bioinks de colágeno en la barrera permeable al gas de acuerdo con el código G cargado con una aguja de plástico de calibre 18 a una presión neumática de aproximadamente 20 kilopascales a 15 grados Celsius. Al final de cada operación de impresión, coloque manualmente una cubierta de vidrio esterilizada de 22 por 50 milímetros en la parte superior de la barrera permeable al gas para generar el gradiente hipóxico. Después de generar tres cáncer hipóxico en chips, transfiera los chips a una incubadora de 37 grados Celsius durante una hora para reticular los bioinks de colágeno.
Cuando se hayan impreso todos los chips hipóxicos contra el cáncer, frote suavemente las gafas de cubierta en la parte superior de las barreras permeables al gas con un raspador celular para una unión estrecha. Para refrescar el medio de cultivo celular a los chips sin separar la construcción del cáncer, incline los chips y use una pipeta para introducir 1.5 mililitros de medio de crecimiento de células endoteliales al lado de cada chip. El cáncer-en-uno-viruta hipóxico fue diseñado en forma de anillos concéntricos para mímico la difusión y el agotamiento radiales del oxígeno observados en tejidos del cáncer.
Después de definir el volumen de control de un espacio en el que el oxígeno es difundido y consumido por las células, se puede determinar una densidad celular apropiada para la generación de hipoxia central a través del análisis computacional de elementos finitos. Sobre la impresión celular 3D, una estructura concéntrica compartimentada del anillo del cáncer-tejido conectador se puede crear para reproducir las características anatómicas del cáncer sólido. Cuantitativamente, la viabilidad de la célula de la postimpresión es típicamente mayor el de 96% que confirma que las condiciones de fabricación son apropiadas para el cáncer y las células stromal.
En este análisis representativo, se compararon dos grupos según la presencia y ausencia del gradiente de oxígeno para verificar los efectos de un gradiente hipóxico sobre la progresión del cáncer. Bajo ambas condiciones, las células endoteliales positivas CD31 maduras estaban presentes dentro de las regiones periféricas, lo que indica que las construcciones vivas modeladas espacialmente se produjeron utilizando la tecnología de bioimpresión 3D. Comparado a la condición negativa del gradiente del oxígeno la condición positiva del gradiente demostró un gradiente hipóxico, indicando la expresión gradual de la alfa HIF1.
Las células pseudopalisaded positivas SHMT2 y las células pluripotent positivas SOX2 también fueron observadas, indicativas de la presencia de características patofisiológicas agresivas del cáncer sólido. El cáncer-en-una-viruta hipóxico es una herramienta útil para investigar las características patofisiológicas de cánceres sólidos y la diafonía dinámica entre las células cancerosas y el tumorigenesis que promueven el microambiente. Como la metodología se puede adaptar para un diseño de fármaco específico para el paciente en un plazo razonable, se espera que este enfoque cierre la brecha entre los modelos de cáncer in vivo e in vitro.
