저산소증은 게놈 불안정과 종양 발생을 유도하는 암 발달의 핵심 동인입니다. 우리는 3D 바이오 프린팅 기술을 기반으로 시험관 내고형 암에서 중앙 저산소증을 생성하는 방법을 시연합니다. 이 방법을 사용하여 3D 인쇄 가스 투과성 장벽과 유리 커버를 결합한 간단한 전략을 사용하여 무선 저산소 그라데이션을 재현할 수 있습니다.
이러한 저산소암 온칩 기술은 환자 특이적 항암제 처방을 용이하게 하기 위해 약물 효능을 예측하는 데 사용될 수 있다. 그리고 그것은 또한 공격적인 암의 빠른 진단을 가능하게 할 것으로 예상됩니다. 3밀리리터 중화 콜라겐 프리젤 용액의 제조를 돕기 위해 30밀리그램 콜라겐 스폰지를 5mm 곱곱피스로 자른다.
멸균 10 밀리리터 유리 바이알에 조각을 넣고 0.2 미크론 주사기 필터 0.1 일반 염산의 2.4 밀리리터를 바이알에 추가하여 섭씨 4도, 분당 15회전으로 3일간 의 배양에 사용한다. 소화 후, 40 미크론 세포 스트레이너를 통해 소화되지 않은 콜라겐 입자를 변형시키고 산성 콜라겐 용액을 섭씨 4도에서 최대 7일 동안 보관하십시오. 1% 중화 콜라겐 프리젤 용액의 pH를 조정하려면, 10X PBS의 최종 농도에 페놀 레드 용액 30마이크로리터를 10%와 300 마이크로리터를 혼합 및 원심분리 후 최종 농도에 추가하고, 일반 수산화 나트륨 1개를 사용하여 3개의 일반 수산화나트륨을 사용하여 총 3개의 미립수를 획득하여 수분 변화를 확인한다.
그런 다음 pH 조정 된 1 % 중화 콜라겐 프리 젤 용액을 섭씨 4도에 저장하여 3 일 이내에 사용합니다. 중화 콜라겐 프리젤 용액의 겔화를 미리 확인하려면 양극률 피펫을 사용하여 작은 접시에 콜라겐 방울 50 마이크로리터를 추가하고 1시간 동안 37°C의 인큐베이터에 물방울을 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 콜라겐이 투명 한 색상에서 불투명한 흰색으로 변경되었는지 확인하십시오.
콜라겐이 용기의 바닥에 부착되어 있는지 확인하기 위해 용기를 기울입니다. 그리고 콜라겐 구조가 용액에 침입하지 않는지 확인하기 위해 액적에 PBS를 부어. 희생 PEVA 금형의 3D 프린팅을 위해 파일을 클릭하고 파일 유형을 STL로 저장하여 3D CAD 파일을 STL 파일로 변환하고 옵션 및 출력 양식을 ASCII로 클릭하여 G 코드를 생성합니다.
생성된 STL 파일을 가져오려면 파일을 클릭하고 STL 파일을 열고 저장된 STL 파일을 선택합니다. 희생 PEVA 금형의 G 코드를 자동으로 생성하려면 STL-CAD 교환기의 슬라이스 모델을 선택합니다. 그런 다음 칩 제조를 위한 인쇄 경로를 생성하려면 섭씨 110도에서 500킬로파스칼의 공압에서 50 게이지 정밀 노즐을 사용하여 희생 PEVA 금형을 멸균 접착제 유혈성 조직성 슬라이드에 인쇄합니다.
PDMS 장벽을 주조하기 위해, 플라스틱 저수지에 5 분 동안 PDMS 베이스 엘라스토머와 600 마이크로 리터의 6 밀리리터를 혼합하고 균일하게 혼합 된 용액을 10 밀리리터 일회용 주사기에 로드합니다. 주사기를 20 게이지 플라스틱 테이퍼 디스펜스 팁으로 장착하고 식소 PEVA 금형을 혼합 된 PDMS 솔루션으로 채웁니다. 혼합 된 PDMS는 볼록한 표면이 희생 PEVA 금형을 채우고 장벽은 금형보다 높을 것입니다.
PEVA의 용융을 피하기 위해 섭씨 40도 오븐에서 PDMS 장벽을 경화한 후 정밀 핀셋 을 사용하여 희생 PEVA 금형을 분리하고 오토클레이브에서 120°C에서 가스 투과성 장벽을 살균합니다. 용액을 암세포와 혼합하려면 각 유형의 수집된 세포 펠릿을 배양 배지 20마이크로리터에 재보중단하고 1밀리리터를 1밀리리터의 1밀리리터를 젖은 얼음의 재일시 중단된 세포 현탁액에 부드러운 혼합으로 첨가한다. 양수 변위 파이펫을 사용하여 각 셀 서스펜션을 혼합합니다.
균일한 용액을 얻을 때, 양극 일회용 파이펫을 사용하여 세포 캡슐화된 콜라겐 바이오잉크를 개별 3밀리리터 일회용 주사기로 옮기고 3D 셀 프린팅까지 주사기를 섭씨 4도에 저장합니다. 암 스트로마 동심 형 링의 3D 프린팅의 경우 적절한 3D CAD 파일을 STL 파일 형식으로 변환하고 STL-CAD 교환기를 사용하여 암 스트로마 동심 링의 G 코드를 생성합니다. 셀 캡슐화된 콜라겐 바이오잉크를 3D 프린터 헤드에 적재하고 헤드와 플레이트의 온도를 섭씨 15도로 설정합니다.
3D 프린터의 제어 소프트웨어에 생성된 인쇄 경로를 로드하고 15도에서 약 20킬로파스칼의 공압으로 18게이지 플라스틱 바늘을 장착한 로드된 G 코드에 따라 콜라겐 바이오잉크를 가스 투과성 장벽에 인쇄하기 시작합니다. 모든 인쇄 작업이 끝나면 저산소 그라데이션을 생성하기 위해 가스 투과성 장벽 위에 멸균 22 x 50mm 유리 커버를 수동으로 배치합니다. 3개의 저산소암-온칩을 생성한 후 칩을 섭씨 37도인 배양기로 1시간 동안 전달하여 콜라겐 바이오잉크를 교차연결합니다.
모든 저산소암온칩이 인쇄되었을 때, 단단한 결합을 위해 세포 스크레이퍼로 가스 투과성 장벽 위에 커버 안경을 부드럽게 문지릅니다. 암 구조를 분리하지 않고 칩에 세포 배양 배지를 새로 고치려면 칩을 기울이고 파이펫을 사용하여 각 칩의 측면에 내피 세포 성장 배지 1.5 밀리리터를 도입한다. 저산소암-온-어칩은 암 조직에서 관찰된 방사형 산소 확산 및 고갈을 모방하기 위해 동심 고리의 형태로 설계되었습니다.
산소가 세포에 의해 확산되고 소모되는 공간의 제어 부피를 정의한 후, 중앙 저산소증 생성에 적합한 세포 밀도는 계산 유한 요소 분석을 통해 결정될 수 있다. 3D 세포 인쇄시, 구획화된 암-스트로마 동심순환 구조를 만들어 고형암의 해부학적 특징을 재현할 수 있다. 정량적으로, 인쇄 후 세포 생존가능성은 전형적으로 96% 이상이며 제조 조건이 암 및 기질 세포에 적합하다는 것을 확인합니다.
본 대표적인 분석에서, 2개의 단은 암 진행에 저산소 그라데이션의 효력을 확인하기 위하여 산소 그라데이션의 존재 그리고 부재에 따라 비교되었다. 두 조건 모두에서 성숙한 CD31 양성 내피 세포는 주변 영역 내에 존재하였고, 이는 공간적으로 패턴이 있는 살아있는 구조물이 3D 바이오프린팅 기술을 사용하여 생산되었음을 나타낸다. 산소 그라데이션 음성 조건에 비해 그라데이션 양성 상태는 HIF1 알파의 점진적발현을 나타내는 저산소 그라데이션을 입증했다.
SHMT2 양성 의사팔수증 세포 및 SOX2 양성 다능성 세포도 관찰되었으며, 이는 고형암의 공격적인 병리학적 특징의 존재를 나타낸다. 저산소암-온-어칩은 고형암의 병리학적 특성과 암세포와 종양발생 사이의 동적 상호토크를 조사하는 데 유용한 도구로 마이크로환경을 촉진한다. 방법론은 합리적인 기간에 환자 특정 약물 설계에 적응 할 수 있기 때문에,이 접근 방식은 암의 생체 내 및 체외 모델 사이의 격차를 해소 할 것으로 예상된다.
