Hypoxie ist ein Schlüsselfaktor für die Krebsentwicklung, der genomische Instabilität und Tumorgenese induziert. Wir demonstrieren eine Methode zur Erzeugung einer zentralen Hypoxie bei einem soliden Krebs in vitro auf Basis der 3D-Bioprinting-Technologie. Mit dieser Methode kann ein radiohypoxischer Gradient mit einer einfachen Strategie reproduziert werden, die eine 3D-gedruckte gasdurchlässige Barriere und eine Glasabdeckung kombiniert.
Diese hypoxische Krebs-On-a-Chip-Technologie kann verwendet werden, um die Wirksamkeit von Medikamenten vorherzusagen, um die patientenspezifische Verschreibung von Krebsmedikamenten zu erleichtern. Und es wird auch erwartet, dass es eine schnelle Diagnose von aggressiven Krebsarten ermöglicht. Um die Herstellung einer drei Milliliter neutralisierten Kollagen-Pre-Gel-Lösung zu unterstützen, schneiden Sie 30 Milligramm Kollagenschwämme in fünf mal fünf Millimeter quadratische Stücke.
Legen Sie die Stücke in eine sterile 10-Milliliter-Glasfläschchen und geben Sie 2,4 Milliliter 0,2-Mikron-Spritzenfilter 0,1 normale Salzsäure in die Durchstechflasche für eine dreitägige Inkubation bei vier Grad Celsius und 15 Umdrehungen pro Minute. Nach der Verdauung alle unverdauten Kollagenpartikel durch ein 40 Mikron Zellsieb abseihen und die saure Kollagenlösung bei vier Grad Celsius bis zu sieben Tage lagern. Um den pH-Wert der 1% neutralisierten Kollagen-Pre-Gel-Lösung einzustellen, fügen Sie 30 Mikroliter Phenolrotlösung zu einer Endkonzentration von 1% und 300 Mikroliter von 10X PBS zu einer Endkonzentration von 10% hinzu Nach dem Mischen und Zentrifugieren verwenden Sie ein normales Natriumhydroxid, um den pH-Wert auf sieben zu neutralisieren, überprüfen Sie die Farbänderung und fügen Sie destilliertes Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von drei Millilitern zu erhalten.
Dann lagern Sie die pH-eingestellte 1% neutralisierte Kollagen-Pre-Gel-Lösung bei vier Grad Celsius für die Verwendung innerhalb von drei Tagen. Um die Gelierung der neutralisierten Kollagen-Pre-Gel-Lösung vorzuprüfen, verwenden Sie eine Verdrängerpipette, um 50 Mikroliter Kollagentröpfchen in eine kleine Schüssel zu geben und die Tröpfchen in einem 37 Grad Celsius Inkubator für eine Stunde zu inkubieren. Überprüfen Sie am Ende der Inkubation, ob sich das Kollagen von einer transparenten Farbe zu einem undurchsichtigen Weiß verändert hat.
Neigen Sie den Behälter, um zu bestätigen, dass das Kollagen am Boden des Behälters haftet. Und gießen Sie PBS auf das Tröpfchen, um zu bestätigen, dass das Kollagenkonstrukt nicht in Lösung bricht. Für den 3D-Druck einer PEVA-Opferform klicken Sie auf Datei und speichern Sie den Dateityp als STL, um die 3D-CAD-Datei in eine STL-Datei zu konvertieren, und klicken Sie auf Option und Ausgabeformular als ASCII, um den G-Code zu generieren.
Um die generierte STL-Datei zu importieren, klicken Sie auf Datei, öffnen Sie die STL-Datei und wählen Sie die gespeicherte STL-Datei aus. Um den G-Code der PEVA-Opferform automatisch zu generieren, wählen Sie das Schnittmodell des STL-CAD-Austauschers aus. Um dann Druckpfade für die Chipherstellung zu generieren, verwenden Sie eine 50-Gauge-Präzisionsdüse bei einem pneumatischen Druck von 500 Kilopascal bei 110 Grad Celsius, um die PEVA-Opferform auf einen sterilen hydrophilen Histologie-Objektträger zu drucken.
Um die PDMS-Barriere zu gießen, mischen Sie sechs Milliliter PDMS-Basiselastomer und 600 Mikroliter Härter fünf Minuten lang in ein Kunststoffreservoir und laden die homogen gemischte Lösung in eine 10-Milliliter-Einwegspritze. Die Spritze mit einer 20-Gauge-Kunststoff-Dosierspitze ausgestattet und die PEVA-Opferform mit der gemischten PDMS-Lösung füllen. Das gemischte PDMS füllt diese PEVA-Opferform mit einer konvexen Oberfläche und die Barriere ist höher als die der Form.
Nachdem Sie die PDMS-Barriere in einem 40-Grad-Celsius-Ofen für über 36 Stunden ausgehärtet haben, um das Schmelzen des PEVA zu vermeiden, verwenden Sie eine Präzisionspinzette, um die PEVA-Opferform zu lösen und die gasdurchlässige Barriere bei 120 Grad Celsius in einem Autoklaven zu sterilisieren. Um die Lösung mit Krebszellen zu mischen, resuspendieren Sie jede Art von gesammeltem Zellpellet in 20 Mikroliter Kulturmedium und fügen Sie einen Milliliter 1% neutralisierte Kollagen-Pre-Gel-Lösung in jede der resuspendierten Zellsuspensionen auf nassem Eis mit sanftem Mischen hinzu. Verwenden Sie eine Verdrängerpipette, um jede Zellsuspension zu mischen.
Wenn homogene Lösungen erhalten werden, verwenden Sie eine positive Einwegpipette, um die zellverkapselten Kollagen-Biotinten in einzelne drei Milliliter-Einwegspritzen zu übertragen und die Spritzen bei vier Grad Celsius bis zum 3D-Zelldruck zu lagern. Für den 3D-Druck von krebs-stroma-konzentrischen Ringen konvertieren Sie die entsprechende 3D-CAD-Datei in ein STL-Dateiformat und verwenden einen STL-CAD-Austauscher, um einen G-Code der konzentrischen Krebs-Stroma-Ringe zu generieren. Laden Sie die zellverkapselten Kollagen-Biotinten in den 3D-Druckerkopf und stellen Sie die Temperatur von Kopf und Platte auf 15 Grad Celsius ein.
Laden Sie den generierten Druckpfad auf die Steuerungssoftware des 3D-Druckers und klicken Sie auf Start, um die Kollagenbiotinten gemäß dem geladenen G-Code mit einer 18-Gauge-Kunststoffnadel bei einem pneumatischen Druck von ca. 20 Kilopascal bei 15 Grad Celsius auf die gasdurchlässige Barriere zu drucken. Legen Sie am Ende jedes Druckvorgangs manuell eine sterilisierte 22 x 50 Millimeter große Glasabdeckung auf die gasdurchlässige Barriere, um den hypoxischen Gradienten zu erzeugen. Nach der Erzeugung von drei hypoxischen Krebs-auf-Chips werden die Chips für eine Stunde in einen 37-Grad-Celsius-Inkubator überführen, um die Kollagen-Biotinten zu vernetzen.
Wenn alle hypoxischen Krebs-auf-einem-Chips gedruckt wurden, reiben Sie die Deckgläser vorsichtig auf die gasdurchlässigen Barrieren mit einem Zellschaber für eine enge Verklebung. Um das Zellkulturmedium zu den Chips aufzufrischen, ohne das Krebskonstrukt zu lösen, neigen Sie die Chips und verwenden Sie eine Pipette, um 1,5 Milliliter Endothelzellwachstumsmedium an die Seite jedes Chips einzuführen. Der hypoxische Krebs-auf-einem-Chip wurde in Form von konzentrischen Ringen entwickelt, um die radiale Sauerstoffdiffusion und -erschöpfung nachzuahmen, die in Krebsgeweben beobachtet werden.
Nach der Definition des Kontrollvolumens eines Raumes, in dem Sauerstoff diffundiert und von Zellen verbraucht wird, kann durch rechnerische Finite-Elemente-Analyse eine geeignete Zelldichte für die zentrale Hypoxie-Erzeugung bestimmt werden. Beim 3D-Zelldruck kann eine kompartimentierte konzentrische Krebs-Stroma-Ringstruktur erstellt werden, um die anatomischen Merkmale des soliden Krebses zu reproduzieren. Quantitativ ist die Lebensfähigkeit der Zellen nach dem Drucken typischerweise größer als 96%, was bestätigt, dass die Herstellungsbedingungen für Krebs- und Stromazellen geeignet sind.
In dieser repräsentativen Analyse wurden zwei Gruppen nach dem Vorhandensein und Fehlen des Sauerstoffgradienten verglichen, um die Auswirkungen eines hypoxischen Gradienten auf das Fortschreiten des Krebses zu überprüfen. Unter beiden Bedingungen waren reife CD31-positive Endothelzellen in den peripheren Regionen vorhanden, was darauf hindeutet, dass räumlich gemusterte lebende Konstrukte mit 3D-Bioprinting-Technologie hergestellt wurden. Im Vergleich zum negativen Sauerstoffgradientenzustand zeigte der gradientenpositive Zustand einen hypoxischen Gradienten, was auf die allmähliche Expression von HIF1 alpha hinweist.
SHMT2-positive pseudopalisadierte Zellen und SOX2-positive pluripotente Zellen wurden ebenfalls beobachtet, was auf das Vorhandensein aggressiver pathophysiologischer Merkmale von solidem Krebs hinweist. Der hypoxische Krebs-on-a-Chip ist ein nützliches Werkzeug, um die pathophysiologischen Eigenschaften solider Krebsarten und das dynamische Übersprechen zwischen Krebszellen und tumorigenessfördernder Mikroumgebung zu untersuchen. Da die Methodik in einem angemessenen Zeitrahmen für ein patientenspezifisches Arzneimitteldesign angepasst werden kann, wird erwartet, dass dieser Ansatz die Lücke zwischen In-vivo- und In-vitro-Krebsmodellen schließt.
