Hipoksi, genomik instabilite ve tümörjeneze neden olan kanser gelişiminin önemli bir itici sürücüsüdür. 3D biyobaskı teknolojisine dayalı katı kanser in vitrounda merkezi hipoksi üretmek için bir yöntem gösteriyoruz. Bu yöntem kullanılarak, bir radyo hipoksik gradyan, 3D baskılı gaz geçirgen bariyeri ve bir cam kapağı birleştiren basit bir strateji kullanılarak çoğaltılabilir.
Çip üzerindeki bu hipoksik kanser teknolojisi, hastaya özgü antikanser ilaç reçetesini kolaylaştırmak için ilaç etkinliğini tahmin etmek için kullanılabilir. Ayrıca agresif kanserlerin hızlı bir şekilde teşhis edilmesini sağlaması bekleniyor. Üç mililitre nötralize kollajen pre-jel çözeltisinin hazırlanmasına yardımcı olmak için, 30 miligram kollajen süngeri beş milimetre kare parçalar halinde kesin.
Parçaları steril 10 mililitrelik bir cam şişeye yerleştirin ve dört santigrat derecede üç günlük bir inkübasyon ve dakikada 15 devir için şişeye 2,4 mililitre 0,2 mikron şırınga filtresi 0,1 normal hidroklorik asit ekleyin. Sindirimden sonra, sindirilmemiş kollajen parçacıklarını 40 mikron hücreli bir süzgeçten süzün ve asidik kollajen çözeltisini yedi güne kadar dört santigrat derecede saklayın. %1 nötralize kollajen pre-jel çözeltisinin pH'ını ayarlamak için, 1% nihai konsantrasyona 30 mikrolitre fenol kırmızı çözeltisi ve 10X PBS'nin 300 mikrolitresini% 10'luk nihai konsantrasyona ekleyin Karıştırma ve santrifüjlemeden sonra, pH'ı yediye nötralize etmek için bir normal sodyum hidroksit kullanın, renk değişimini doğrulayın ve toplam üç mililitre hacim elde etmek için damıtılmış su ekleyin.
Ardından pH ayarlı %1 nötralize kollajen pre-jel çözeltisini üç gün içinde kullanılmak üzere dört santigrat derecede saklayın. Nötralize kollajen pre-jel çözeltisinin jelasyonunu önceden kontrol etmek için, küçük bir kaba 50 mikrolitre kollajen damlacık eklemek ve damlacıkları 37 santigrat derecelik bir inkübatörde bir saat kuluçkaya yatırmak için pozitif bir deplasman pipet kullanın. Kuluçkanın sonunda, kolajenin şeffaf bir renkten opak beyaza değişip değişmediğini kontrol edin.
Kollajenin kabın altına yapışdığını onaylamak için kabı eğin. Ve kolajen yapının çözeltide kırılmadığını onaylamak için PBS'yi damlacık üzerine dökün. Kurbanlık PEVA kalıbının 3D baskısı için, Dosya'yı tıklatın ve dosya türünü STL olarak kaydedin, 3D CAD dosyasını bir STL dosyasına dönüştürün ve G kodunu oluşturmak için Seçenek ve çıktı formunu ASCII olarak tıklatın.
Oluşturulan STL dosyasını almak için Dosya'yı tıklatın ve STL dosyasını açın ve kaydedilen STL dosyasını seçin. Kurbanlık PEVA kalıbının G kodunu otomatik olarak oluşturmak için STL-CAD eşanjörünün dilim modelini seçin. Daha sonra talaş imalatı için baskı yolları oluşturmak için, kurban peva kalıbını steril yapışkan hidrofilik histoloji slaydına yazdırmak için 110 santigrat derecede 500 kilopaskal pnömatik basınçta 50 ölçer hassas nozül kullanın.
PDMS bariyerini dökmek için, plastik bir rezervuarda beş dakika boyunca altı mililitre PDMS taban elastomeri ve 600 mikrolitre kürleyici maddeyi karıştırdı ve homojen bir şekilde karıştırılmış çözeltiyi 10 mililitrelik tek kullanımlık bir şırıngaya yükleyin. Şırınnayı 20 kalibrelik plastik konik dağıtım ucu ile donatın ve kurbanlık PEVA kalıbını harmanlanmış PDMS çözeltisi ile doldurun. Harmanlanmış PDMS, bu kurbanlık PEVA kalıbını dışbükey bir yüzeyle dolduracak ve bariyer kalıbınkinden daha yüksek olacaktır.
PEVA'nın erimesini önlemek için PDMS bariyerini 40 santigrat derece fırında 36 saatten fazla kür ettikten sonra, kurban peva kalıbını ayırmak ve gaz geçirgen bariyerini bir otoklavda 120 santigrat derecede sterilize etmek için bir çift hassas cımbız kullanın. Çözeltiyi kanser hücreleriyle karıştırmak için, toplanan her hücre peletini 20 mikrolitrelik kültür ortamında yeniden biriktirin ve ıslak buzdaki yeniden sulandırılmış hücre süspansiyonlarının her birine bir mililitre nötralize kollajen ön jel çözeltisi ekleyin. Her hücre süspansiyonu karıştırmak için pozitif bir deplasman pipeti kullanın.
Homojen çözeltiler elde edildiğinde, hücre kapsüllenmiş kollajen biyoinkslerini tek tek üç mililitre tek kullanımlık şırınglara aktarmak ve şırıngları 3D hücre baskısına kadar dört santigrat derecede saklamak için pozitif bir tek kullanımlık pipet kullanın. Kanser-stroma eşmerkezli halkaların 3D baskısı için, uygun 3D CAD dosyasını bir STL dosya formatına dönüştürün ve kanser-stroma eşmerkezli halkaların G kodunu oluşturmak için bir STL-CAD eşanjörü kullanın. Hücre kapsüllü kollajen biyoinkslerini 3D yazıcı kafasına yükleyin ve kafa ve plaka sıcaklığını 15 santigrat dereceye ayarlayın.
Oluşturulan baskı yolunu 3D yazıcının kontrol yazılımına yükleyin ve kollajen biyoinkslerini 15 santigrat derecede yaklaşık 20 kilopaskal pnömatik basınçta 18 kalibrelik plastik iğne ile yüklü G koduna göre gaz geçirgen bariyerine yazdırmak için Başlat'ı tıklatın. Her baskı işleminin sonunda, hipoksik gradyanı oluşturmak için gaz geçirgen bariyerinin üzerine manuel olarak sterilize edilmiş 22 ila 50 milimetre cam kapak yerleştirin. Üç hipoksik kanser çipi ürettikten sonra, kollajen biyoinkslerini çapraz bağlamak için çipleri bir saat boyunca 37 santigrat derece inkübatöre aktarın.
Tüm hipoksik kanser-on-a-çipler basıldığında, kapak camlarını sıkı yapıştırma için bir hücre kazıyıcı ile gaz geçirgen bariyerlerinin üzerine hafifçe sürün. Kanser yapısını ayırmadan hücre kültürünü cipslere yenilemek için, çipleri eğin ve her çipin yanına 1,5 mililitre endotel hücre büyüme ortamı tanıtmak için bir pipet kullanın. Çip üzerindeki hipoksik kanser, kanser dokularında gözlenen radyal oksijen difüzyonunu ve tükenmesini taklit etmek için eşmerkezli halkalar şeklinde tasarlanmıştır.
Oksijenin hücreler tarafından dağınık ve tüketilmekte olduğu bir alanın kontrol hacmi belirlendikten sonra, hesaplamalı sonlu eleman analizi ile merkezi hipoksi üretimi için uygun bir hücresel yoğunluk belirlenebilir. 3D hücre baskısı üzerine, katı kanserin anatomik özelliklerini yeniden üretmek için bölümlere ayrılmış bir kanser-stroma eşmerkezli halka yapısı oluşturulabilir. Nicel olarak, baskı sonrası hücre canlılığı tipik olarak% 96'dan fazladır ve üretim koşullarının kanser ve stromal hücreler için uygun olduğunu doğrular.
Bu temsili analizde, hipoksik gradyanın kanser ilerlemesi üzerindeki etkilerini doğrulamak için oksijen gradyanının varlığına ve yokluğuna göre iki grup karşılaştırıldı. Her iki koşulda da periferik bölgelerde olgun CD31 pozitif endotel hücreleri mevcuttu ve bu da mekansal olarak desenli yaşam yapılarının 3D biyobaskı teknolojisi kullanılarak üretildiğini gösteriyordu. Oksijen gradyanı negatif durumu ile karşılaştırıldığında, gradyan pozitif durumu HIF1 alfanın kademeli ekspresyonunun gösterdiği hipoksik bir gradyan göstermiştir.
SHMT2 pozitif psödomalisaded hücreler ve SOX2 pozitif pluripotent hücreler de gözlendi, bu da katı kanserin agresif patofizyolojik özelliklerinin varlığını gösterdi. Çip üzerindeki hipoksik kanser, katı kanserlerin patofizyolojik özelliklerini ve kanser hücreleri ile mikroçevrimi destekleyen tümörogenez arasındaki dinamik çapraz sapı araştırmak için yararlı bir araçtır. Metodoloji makul bir zaman diliminde hastaya özgü bir ilaç tasarımına uyarlanabilebildiğinden, bu yaklaşımın in vivo ve in vitro kanser modelleri arasındaki boşluğu kapatması beklenebilir.
