低酸素症は、ゲノム不安定性および腫瘍形成を誘発する癌の開発の重要な原動力である。3Dバイオプリンティング技術を用いたインビトロの固形癌で中枢低酸素症を発生させる方法を実証する。この方法を使用すると、3Dプリントガス透過バリアとガラスカバーを組み合わせた簡単な戦略を用いて、ラジオ低酸素勾配を再現することができます。
この低酸素癌オンチップ技術は、患者固有の抗癌薬処方を促進するために薬物有効性を予測するために使用することができる。また、積極的な癌の迅速な診断を可能にすることも期待されています。3ミリリットル中和コラーゲンプレゲル溶液の調製を支援するために、30ミリグラムのコラーゲンスポンジを5×5ミリメートル平方体に切った。
滅菌10ミリリットルガラスバイアルに入れ、0.2ミクロンのシリンジフィルター0.1通常塩酸をバイアルに2.4ミリリットル加え、摂氏4度で3日間のインキュベーションを行い、毎分15回転します。消化後、40ミクロンの細胞ストレーナーを介して未消化のコラーゲン粒子をひずみ、酸性コラーゲン溶液を摂氏4度で最大7日間貯蔵する。1%中和コラーゲンプレゲル溶液のpHを調整するには、フェノールレッド溶液の30マイクロリットルを1%の最終濃度に加え、10XPBSの最終濃度に300マイクロリットルを加え、混合および遠心分離後の最終濃度10%に、通常の水酸化ナトリウム1個を使用してpHを7に中和し、色変化を確認し、蒸留水を3リットル単位に加えます。
その後、pH調整された1%中和コラーゲンプレゲル溶液を摂氏4度で保存し、3日以内に使用します。中和したコラーゲンプレゲル溶液のゲル化を事前にチェックするには、プラス変位ピペットを使用して50マイクロリットルのコラーゲン液滴を小皿に加え、37°Cのインキュベーターで液滴を1時間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、コラーゲンが透明色から不透明な白色に変化したかどうかを確認します。
容器を傾けて、コラーゲンが容器の底に付着していることを確認します。そして、溶液中にコラーゲンコンストラクトが壊れていないことを確認するために、液滴にPBSを注ぎます。犠牲 PEVA 金型の 3D 印刷の場合は、[ファイル] をクリックしてファイル タイプを STL として保存し、3D CAD ファイルを STL ファイルに変換し、[オプション] をクリックしてフォームを ASCII として出力して G コードを生成します。
生成された STL ファイルをインポートするには、[ファイル] をクリックして STL ファイルを開き、保存した STL ファイルを選択します。犠牲 PEVA 金型の G コードを自動的に生成するには、STL-CAD 交換器のスライス モデルを選択します。その後、チップ製造用の印刷経路を生成するには、摂氏110度で500キロパスカルの空気圧で50ゲージの精密ノズルを使用して、犠牲PEVA型を無菌接着剤親水構造スライドに印刷します。
PDMSバリアをキャストするには、PDMSベースエラストマー6ミリリットルと600マイクロリットルの硬化剤をプラスチック製の貯蔵所に5分間混合し、均質にブレンドされた溶液を10ミリリットルの使い捨て注射器にロードする。20ゲージのプラスチックのテーパードディスペンサーチップをシリンジに装備し、ブレンドPDMS溶液で犠牲PEVA金型を充填します。ブレンド PDMS はこの犠牲 PEVA 金型を凸面で埋め、バリアは金型よりも高くなります。
PEVAを溶かさないように、40°CのオーブンでPDMSバリアを36時間以上硬化させた後、精密ピンセットを使用して犠牲PEVA型を取り外し、オートクレーブで摂氏120度でガス透過性バリアを滅菌します。溶液を癌細胞と混合するには、採取した各細胞ペレットを20マイクロリットルの培養培地に再懸濁し、1%中和したコラーゲンプレゲル溶液を、ウェットアイス上の各再懸濁細胞懸濁液に1ミリリットル加え、穏やかな混合を行う。各細胞懸濁液を混合するために正の変位ピペットを使用してください。
均質な溶液が得られたら、正の使い捨てピペットを使用して、細胞内包化されたコラーゲンバイオインを個々の3ミリリットルの使い捨て注射器に移し、3D細胞印刷まで4°Cで注射器を保存します。がん-ストロマ同心円環の3Dプリントでは、適切な3D CADファイルをSTLファイル形式に変換し、STL-CAD交換器を使用してがん間質同心円環のGコードを生成します。細胞にカプセル化したコラーゲンバイオインを3Dプリンタヘッドにセットし、頭とプレートの温度を摂氏15度に設定します。
生成された印刷パスを3Dプリンタの制御ソフトウェアにロードし、[開始]をクリックして、18ゲージのプラスチック針を搭載したGコードに従って、15°Cで約20キロパスカルの空気圧でコラーゲンバイオインクをガス透過性バリアに印刷します。すべての印刷操作の終わりに、手動で低酸素勾配を生成するガス透過性バリアの上に殺菌された22 x 50ミリメートルのガラスカバーを置きます。3つの低酸素癌オンチップを生成した後、チップを37°Cのインキュベーターに1時間移し、コラーゲンバイオインクを架橋します。
低酸素がんオンチップがすべて印刷されたら、ガス透過性バリアの上にカバーグラスをセルスクレーパーで軽くこすり、密着性を保ちます。癌構築物を取り外すことなく細胞培養培地をチップにリフレッシュするには、チップを傾け、ピペットを使用して各チップの側面に1.5ミリリットルの内皮細胞増殖培地を導入する。低酸素癌オンチップは、同心円状のリングの形で、癌組織で観察された放射状酸素拡散と枯渇を模倣するように設計された。
酸素が拡散して細胞によって消費される空間の制御容積を定義した後、中枢低酸素発生のための適切な細胞密度を計算的有限要素解析によって決定することができる。3D細胞印刷では、固体癌の解剖学的特徴を再現するために、区画化された癌間質同心環構造を作成することができる。定量的には、ポストプリンティング細胞の生存率は、典型的には、癌および間質細胞に対して製造条件が適切であることを確認する96%より大きい。
本代表分析では、酸素勾配の有無に応じて2つの群を比較し、低酸素勾配が癌進行に及ぼす影響を検証した。いずれの条件においても、成熟したCD31陽性内皮細胞が周辺領域内に存在し、空間パターン化された生きている構築物が3Dバイオプリンティング技術を用いて作製されたことを示している。酸素勾配負条件と比較すると、勾配陽性条件は低酸素勾配を示し、HIF1アルファの徐々な発現を示した。
SHMT2陽性擬似パリセド細胞およびSOX2陽性多能性細胞も認められており、固形癌の積極的な病態生理学的特徴の存在を示す。低酸素がんオンチップは、固形癌の病態生理学的特徴と、微小環境を促進する癌細胞と腫瘍形成との間の動的クロストークを調べるための有用なツールである。この方法論は合理的な時間枠で患者固有の薬物設計に適応することができるので、このアプローチは、in vivoと癌のインビトロモデルとの間のギャップを埋めることが期待される。
