El protocolo combina el aislamiento específico de la edad de cultivos mixtos espontáneos derivados de células madre neurales que contienen células precursoras de oligodendrocitos diferenciadores y astrocitos, ensayos que imitan condiciones patológicas y lecturas robustas y de alto contenido. Estas características permiten estudiar diferencialmente la mielinización del desarrollo y la remielinización adulta en condiciones fisiológicas y patológicas y en un microambiente que tiene en cuenta la contribución de los astrocitos. Para el aislamiento de células madre neurales de los cerebros anteriores fetales embrionarios del día 13.5 al 14.5, coloque las cabezas de los embriones en una placa de Petri limpia con PBS helado y use fórceps para eliminar la piel del cráneo bajo aumento.
Una vez que el cerebro esté visible y despejado de piel, use fórceps para exprimir el cerebro del cráneo y extirpar el cerebelo. Use las pinzas para quitar las meninges y coloque el tejido aislado en el tampón de disociación no enzimática. Cuando se haya aislado todo el tejido cerebral, extraiga de dos a tres muestras en 150 microlitros de tampón de disociación no enzimática por tubo de 1,5 mililitros e incube los tubos durante 15 minutos a 37 grados centígrados con agitación continua.
Al final de la incubación, agregue 850 microlitros de medio estándar a cada tubo y pipeta para mezclar hasta que la suspensión esté libre de grumos. Si el tejido no disociado todavía es visible, deje que las muestras descansen durante dos minutos para permitir que los tejidos se asienten en la parte inferior de los tubos. Cuando se completa la disociación, placas de células a una densidad de 10 a 50 células por microlitro en 10 a 30 mililitros de concentración de medio de neuroesfera en un matraz T25 o T45, y coloque el matraz en la incubadora de cultivo celular en posición vertical para evitar la unión celular.
de ratones adultos de 2,5 meses de edad, coloque cerebros de cuatro a cinco ratones adultos en un tubo de 50 mililitros de HBSS helado y coloque un cerebro, ventral hacia abajo, en la dirección rostral-caudal en un matraz estéril cubierto de papel de aluminio lleno de menos 20 grados centígrados durante la noche con agua fría. Use una cuchilla de afeitar para quitar los bulbos olfativos y cortar de dos a tres rodajas coronales de un milímetro de grosor desde la corteza hasta el quiasma óptico. Coloque las rodajas sobre la superficie fría en una posición ventro-dorsal e identifique el cuerpo calloso y los dos ventrículos laterales.
Usando la ampliación, aísle las paredes de los ventrículos laterales, teniendo cuidado de no incluir trozos del cuerpo calloso, y coloque el tejido aislado en cinco a 10 mililitros de tampón de disociación enzimática durante una incubación de 15 minutos a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, pipetee los tejidos al menos 50 veces antes de incubar las muestras a 37 grados centígrados durante 10 minutos adicionales. Al final de la incubación, neutralice la tripsina con cinco mililitros de medio de cultivo estándar y filtre la suspensión de tejido a través de un filtro de 70 micras.
Centrifugar la solución filtrada durante cinco minutos a 400 veces g, y volver a suspender el pellet en solución de sacarosa para una segunda centrifugación. Al final de la centrifugación, vuelva a suspender el pellet en la solución de lavado de albúmina sérica bovina para otra centrifugación, luego vuelva a suspender el pellet en el medio de cultivo estándar para contar y colocar las células en un matraz vertical T-25 o T-45. Para la diferenciación primaria de la neuroesfera, agregue factores básicos de fibroblastos y crecimiento endotelial al cultivo de células madre neurales cada dos días.
Cuando las neuroesferas alcanzan un diámetro de 100 a 500 micras, pasa las células por disociación mecánica de acuerdo con los protocolos estándar. Para la diferenciación de la oligoesfera, trate las células con factor de crecimiento básico de fibroblastos en el factor AA derivado de plaquetas cada dos días. Cuando las oligoesferas alcanzan un diámetro de 100 a 150 micras, disociar las esferas por disociación mecánica de acuerdo con los protocolos estándar y sembrar la suspensión celular a una densidad de 3000 células por centímetro cuadrado en placas recubiertas de laminina de poli-DL-ornitina.
Después de tres días, reemplace el sobrenadante de cada cultivo con el mismo volumen de medio de diferenciación de oligodendrocitos. Para realizar una inducción de bloques de diferenciación mediada por la inflamación, después de la disociación de las neuroesferas y durante la producción de oligoesferas, agregue la mezcla de citoquinas de interés al medio de cultivo. Para inducir la muerte celular por privación de oxígeno-glucosa, dos días después de la siembra en las placas de múltiples pocillos, transfiera el sobrenadante de cada cultivo a los pocillos individuales de una placa de múltiples pocillos.
Agregue la mitad del volumen del medio OGD a los pozos y transfiera los cultivos a una cámara de hipoxia hermética saturada con 95% de nitrógeno y 5% de dióxido de carbono. Coloque la cámara en la incubadora de cultivo celular. Después de tres horas, reemplace el medio en las cámaras con el medio apartado de la placa de cultivo de múltiples pozos.
Después de verificar la calidad de la tinción celular, en el menú Adquisición del software de detección de alto contenido, seleccione Tiempo de exposición fijo y Mini escaneo, y seleccione 10 campos por pozo y dos pozos por condición experimental para permitir que los parámetros de análisis en el subconjunto de campos se establezcan para toda la placa. Siga el flujo de trabajo paso a paso para desarrollar todo el algoritmo. Seleccione Procesar imagen para cada canal y haga clic en Eliminación de fondo para seleccionar el nivel de señal deseado.
Para identificar y seleccionar los núcleos por tinción nuclear, haga clic en Identificar objeto primario, ajuste el umbral para identificar núcleos individuales y haga clic en Validar objetos primarios para establecer los umbrales en función de las áreas y la posición del objeto. Haga clic en Identificar puntos para cada canal correspondiente a los marcadores de linaje específicos y establezca el ancho del valor del anillo en tres y la distancia en cero para permitir la identificación de la fluorescencia citoplasmática. Seleccione Niveles de referencia en el flujo de trabajo para crear el análisis y permitir el recuento automático de los núcleos condensados en función del tamaño nuclear y la intensidad de la tinción nuclear y de las células marcadoras positivas específicas en función de la fluorescencia citoplasmática identificada por el anillo y, a continuación, haga clic en Reproducir.
Durante la primera fase del cultivo, las células madre neurales mantienen su expresión de nestina. La mayoría de las células también son NG2-positivas. Las células CNPasa positivas correspondientes a la etapa pre-oligodendrocitos son detectables de tres a seis días después de la inducción de diferenciación mediada por T3, mientras que los oligodendrocitos MADUROS MBP positivos aparecen en un porcentaje significativo después de seis a 12 días in vitro.
El análisis de cribado de alto contenido permite la detección de células individuales dentro del cultivo a través de la tinción nuclear y el análisis de intensidad de fluorescencia. La composición del cultivo al final de la fase de diferenciación difiere en función de si los cultivos son de origen fetal o adulto, con cultivos fetales más sensibles a la diferenciación mediada por T3, y alcanzando un mayor porcentaje de oligodendrocitos maduros. Tenga en cuenta que cuando las células precursoras de oligodendrocitos derivadas de células madre neurales se siembran a una alta densidad, se agregan y los astrocitos que se replican producen rápidamente una capa celular confluente, lo que impide la observación de la forma característica de la red de araña de los oligodendrocitos maduros.
El bloqueo de la diferenciación mediado por la inflamación induce una fuerte disminución de los oligodendrocitos pre y maduros, según lo detectado por la tinción de CNPasa y MBP en cultivos fetales y adultos. También se produce un aumento en el número de células precursoras de oligodendrocitos en cultivos adultos tratados con citoquinas. Mientras que las células precursoras de oligodendrocitos fetales y adultas muestran lo mismo a la exposición inflamatoria a citoquinas, solo los cultivos derivados del feto son sensibles a la toxicidad por privación de oxígeno y glucosa.
El método se puede implementar con cualquier tipo de células precursoras de oligodendrocitos, proceso de interferencia de diferenciación y maduración, para probar nuevas estrategias destinadas a combatir enfermedades que afectan la mielinización o la remielinización.
