このプロトコルは、分化オリゴデンドロサイト前駆細胞と星状細胞を含む神経幹細胞由来の自発的混合培養物の年齢特異的分離、病理学的状態を模倣するアッセイ、および堅牢で高含有量の読み出しを組み合わせたものです。これらの特徴は、生理学的および病理学的状態および星状細胞の寄与を考慮した微小環境における発達髄鞘化および成人再髄形成を差異的に研究することを可能にする。胚性13.5日目から14.5日目の胎児前脳からの神経幹細胞分離のために、胚の頭部を氷冷PBSできれいなペトリ皿に入れ、鉗子を使って拡大の下で頭蓋骨から皮膚を取り除く。
脳が見え、皮膚から取り除いたら、鉗子を使って頭蓋骨から脳を絞り出し、小脳を取り除きます。鉗子を使用して髄を取り除き、単離した組織を非酵素解離緩衝液に入れる。脳組織のすべてが単離されたら、1.5ミリリットルチューブあたり150マイクロリットルの非酵素解離バッファーで2〜3サンプルを引っ張り、連続的な揺れで摂氏37度で15分間チューブをインキュベートします。
インキュベーションの最後に、各チューブとピペットに850マイクロリットルの標準媒体を加えて、懸濁液に塊がなくなるまで混合します。解約されていない組織がまだ見える場合は、サンプルを2分間休ませて、組織がチューブの底に落ち着くようにします。解離が完了すると、T25またはT45フラスコ中の神経圏培地濃度の10〜30ミリリットルで1マイクロリットル当たり10〜50細胞の密度でプレート細胞を、細胞結合を防止するために、細胞培養インキュベーターにフラスコを垂直位置に置いた。
生後2.5ヶ月の成体マウスから、4匹から5匹の成体マウスの脳を氷冷HBSSの50ミリリットルチューブに入れ、マイナス20度の一晩冷たい水で満たされた無菌アルミニウム箔で覆われたフラスコの上の1つの脳、腹側を下に置く。カミソリの刃を使用して嗅球を取り除き、皮質から光学チアスマに厚さ1ミリメートルのコロナスライスを2~3個カットします。冷たい表面にスライスを心室の側寄りの位置に置き、コーパス・カロスムと2つの側心室を識別します。
倍率を使用して、側心室の壁を分離し、コーパス梁の破片を含めないように注意し、37°Cで15分間の酵素解離バッファーの5〜10ミリリットルに単離された組織を置きます。インキュベーションの終わりに、組織を少なくとも50回ピペットしてから、さらに10分間摂氏37度でサンプルをインキュベートする。インキュベーションの最後に、5ミリリットルの標準的な培養培地でトリプシンを中和し、70ミクロンのフィルターを介して組織懸濁液を濾過する。
濾過溶液を400回gで5分間遠心し、2回目の遠心分離のためにスクロース溶液中のペレットを再懸濁した。遠心分離の終わりに、別の遠心分離のためにウシ血清アルブミン洗浄液中のペレットを再中断し、次に、細胞を直立T-25またはT-45フラスコにプレートする標準培養液中のペレットを再中断し、プレートする。一次神経球分化の場合、2日ごとに神経幹細胞培養に基本的な線維芽細胞および内皮成長因子を加える。
神経球が直径100~500ミクロンに達すると、標準的なプロトコルに従って機械的解離によって細胞を通過する。オリゴスフィア分化の場合、2日ごとに血小板由来因子AAの基本的な線維芽細胞増殖因子を有する細胞を治療する。オリゴスフィアが直径100~150ミクロンに達したら、標準的なプロトコルに従って機械的解離によって球体を解離し、細胞懸濁液を3000細胞/平方センチメートルの密度でポリDL-オルニチンラミニンコーティングプレートに播種します。
3日後、各培養物の上清を同量のオリゴデンドロシテ分化培地に交換する。炎症媒介分化ブロック誘導を行うために、神経圏解離後およびオリゴスフェア産生時に、目的のサイトカインミックスを培養培地に添加する。酸素グルコース欠乏細胞死を誘導するために、マルチウェルプレートに播種した2日後に、上清を各培養物からマルチウェルプレートの個々のウェルに移す。
井戸にOGD培地の半分の体積を加え、95%の窒素と5%の二酸化炭素で飽和気密性低酸素室に培養液を移します。チャンバーを細胞培養インキュベーターに入れます。3時間後、チャンバー内の培地を、マルチウェル培養プレートから取り除いた培地に交換します。
細胞染色の品質を確認した後、高コンテンツスクリーニングソフトウェアの取得メニューで、固定露光時間とミニスキャンを選択し、1つのウェルあたり10のフィールドと実験条件ごとに2つのウェルを選択して、プレート全体に対してフィールドのサブセット内の分析パラメータを設定できるようにします。ワークフローに従って、アルゴリズム全体を開発します。各チャンネルの[プロセスイメージ]を選択し、[バックグラウンド除去]をクリックして、希望の信号レベルを選択します。
核染色によって核を識別して選択するには、「主オブジェクトを識別」をクリックし、しきい値を調整して単一の核を識別し、「プライマリオブジェクトを検証」をクリックして、オブジェクト領域と位置に基づいてしきい値を設定します。特定の系統マーカーに対応する各チャンネルのスポットを識別するをクリックし、リング値の幅を3に、距離をゼロに設定して、細胞プラズマ蛍光を識別できるようにします。分析を構築し、核サイズと核染色強度に基づいて凝縮核の自動カウントを可能にするワークフローの参照レベルを選択し、リングによって識別された細胞プラズマ蛍光に基づく特定のマーカー陽性細胞の、再生をクリックします。
培養の第1段階では、神経幹細胞はネスチン発現を維持する。細胞の大部分はNG2陽性でもある。前オリゴデンドロサイトステージに対応するCNPase陽性細胞は、T3媒介分化誘導の3〜6日後に検出可能であり、一方、成熟したMBP陽性オリゴデンドロサイトは、インビトロで6〜12日後に有意な割合で現れる。
高含有スクリーニング分析により、核染色および蛍光強度解析を通じて培養中の単一細胞の検出が可能になります。分化段階の終わりに培養物の組成は、T3媒介分化に対する胎児培養の反応が良く、成熟したオリゴデンドロサイトの割合が高い胎児の起源の培養物であるかによって異なる。なお、神経幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞を高密度で播種すると、凝集し、凝集し、凝集したアストロサイトを複製すると、結合細胞層が急速に生成され、成熟したオリゴデンドロサイトの特徴的なクモ正味形状の観察が妨げられることに注意してください。
炎症媒介性の分化遮断は、胎児および成人培養の両方でCNPaseおよびMBP染色によって検出される前および成熟したオリゴデンドロサイトの強い減少を誘発する。オリゴデンドロサイト前駆細胞の数の増加は、サイトカイン処理された成体培養においても起こる。胎児および成人オリゴデンドロサイト前駆細胞は炎症性サイトカイン曝露に対して同じことを示しているが、胎児由来の培養物だけが酸素グルコース欠乏毒性に敏感である。
この方法は、あらゆる種類のオリゴデンドロシ細胞、分化および成熟妨害プロセスで実施し、髄鞘化または再髄鞘化に影響を及ぼす疾患との闘いを目的とした新しい戦略をテストすることができる。
