הפרוטוקול משלב בידוד ספציפי לגיל של תרביות מעורבות ספונטניות שמקורן בתאי גזע עצביים המכילות תאים ומבשרי אוליגודנדרוציטים מבדילים בין תאים ואסטרוציטים, בדיקות המחקות תנאים פתולוגיים וקריאות חזקות בעלות תוכן גבוה. מאפיינים אלה מאפשרים לחקור באופן דיפרנציאלי מיאלינציה התפתחותית ו remyelination למבוגרים בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים ובמיקרו-סביבה שלוקחת בחשבון את תרומתם של אסטרוציטים. לבידוד תאי גזע עצביים מיום עוברי 13.5 עד 14.5 עצמות עובריות, הניחו את ראשי העוברים בצלחת פטרי נקייה עם PBS קר כקרח והשתמשו במלקחיים כדי להסיר את העור מהגולגולת תחת הגדלה.
ברגע שהמוח נראה ומנוקה מהעור, השתמש במלקחיים כדי לסחוט את המוח מהגולגולת ולהסיר את המוח הקטן. השתמש במלקחיים כדי להסיר את קרום המוות ולהניח את הרקמה המבודדת במאגר הניתוק הלא אנזימטי. כאשר כל רקמת המוח מבודדת, למשוך שתיים עד שלוש דגימות ב 150 microliters של חוצץ דיסוציאציה לא אנזימטי לכל צינור 1.5 מיליליטר, ולדגירה על הצינורות במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד מתמשך.
בסוף הדגירה, מוסיפים 850 מיקרוליטרים של מדיום סטנדרטי לכל צינור ופיפטה לערבב עד שהמתלים נקיים מגושים. אם רקמות שאינן מנותקות עדיין גלויות, אפשרו לדגימות לנוח במשך שתי דקות כדי לאפשר לרקמות להתיישב לתחתית הצינורות. כאשר הניתוק הושלם, תאי צלחת בצפיפות של 10 עד 50 תאים למיקרוליטר ב 10 עד 30 מיליליטר של ריכוז בינוני נוירוספירה בבקבוק T25 או T45, ומניחים את הבקבוק באינקובטור תרבית התא במצב אנכי כדי למנוע התקשרות לתא.
מעכברים בוגרים בני 2.5 חודשים, הניחו את המוחות מארבעה עד חמישה עכברים בוגרים בצינור של 50 מיליליטר של HBSS קר כקרח והניח מוח אחד, בצד הגחוני כלפי מטה, בכיוון הרוסטרל-caudal על בקבוקון אלומיניום סטרילי מכוסה רדיד מלא במים קרים של מינוס 20 מעלות צלזיוס בלילה. השתמש בסכין גילוח כדי להסיר את נורות הריח ולחתוך שתיים עד שלוש פרוסות קורונל בעובי מילימטר אחד מקליפת המוח אל הצ'יאזמה האופטית. מניחים את הפרוסות על המשטח הקר בתנוחת חדר-דור, ומזהים את הקורפוס קאלוסום ואת שני החדרים לרוחב.
באמצעות הגדלה, לבודד את הקירות של החדרים לרוחב, דואג לא לכלול חתיכות של קלוסום קורפוס, ולהניח את הרקמה המבודדת בחמישה עד 10 מיליליטר של חוצץ דיסוציאציה אנזימטית עבור דגירה של 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, pipette את הרקמות לפחות 50 פעמים לפני הדגירה של הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות נוספות. בסוף הדגירה, לנטרל את טריפסין עם חמישה מיליליטר של מדיום תרבות סטנדרטי ולסנן את ההשעיה רקמה באמצעות מסנן 70 מיקרון.
צנטריפוגה הפתרון מסונן במשך חמש דקות ב 400 פעמים g, ולהשעות מחדש את הכדור בתמיסת סוכרוז עבור צנטריפוגה שנייה. בסוף צנטריפוגה, להשעות מחדש את הכדור בתמיסת שטיפת אלבומין סרום בקר עבור צנטריפוגה נוספת, ולאחר מכן להשעות מחדש את הכדור במדיום תרבית סטנדרטי לספירה צלחת את התאים בבקבוקון T-25 או T-45 זקוף. לבידול נוירוספירה ראשוני, הוסף גורמי גדילה בסיסיים פיברובלסט אנדותל לתרבות תאי הגזע העצביים כל יומיים.
כאשר הנוירוספרות מגיעות לקוטר של 100 עד 500 מיקרון, מעבר התאים על ידי דיסוציאציה מכנית על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. עבור בידול אוליגוספירה, לטפל בתאים עם גורם גדילה פיברובלסט בסיסי פקטור-AA נגזר טסיות דם כל יומיים. כאשר האוליגוספירות מגיעות לקוטר של 100 עד 150 מיקרון, נתק את הכדורים על ידי דיסוציאציה מכנית על פי פרוטוקולים סטנדרטיים וזרע את ההשעיה של התא בצפיפות של 3000 תאים לסמ"ר על לוחות מצופים למינין פולי-DL-אורניתין.
לאחר שלושה ימים, להחליף את supernatant של כל תרבות עם אותו נפח של מדיום בידול אוליגודנדרוציטים. כדי לבצע אינדוקציה בלוק בידול בתיווך דלקת, לאחר דיסוציאציה נוירוספירה ובמהלך ייצור אוליגוספירה, להוסיף את תערובת ציטוקינים של עניין למדיום התרבות. כדי לגרום למוות תאי מניעת חמצן-גלוקוז, יומיים לאחר זריעת לתוך לוחות מרובי בארות, להעביר את supernatant מכל תרבות לתוך בארות בודדות של צלחת מרובת בארות.
הוסף מחצית מהנפח של מדיום OGD לבארות, והעביר את התרבויות לתא היפוקסיה אטום רווי ב-95% חנקן ו-5% פחמן דו-חמצני. מניחים את התא באינקובטור תרבית התאים. לאחר שלוש שעות, להחליף את המדיום בתאים עם המדיום להפריש את צלחת התרבות רב טוב.
לאחר בדיקת איכות הכתמת התא, בתפריט הרכישה של תוכנת ההקרנה בעלת התוכן הגבוה, בחר זמן חשיפה קבוע וסריקת Mini, ובחר 10 שדות לבאר ושתי בארות לכל מצב ניסיוני כדי לאפשר להגדיר את פרמטרי הניתוח בתת-קבוצה של שדות לכל הצלחת. בצע את זרימת העבודה צעד אחר צעד כדי לפתח את האלגוריתם כולו. בחרו 'תמונת תהליך' עבור כל ערוץ ולחצו על 'הסרת רקע' כדי לבחור את רמת האות הרצויה.
כדי לזהות ולבחור את הגרעינים על-ידי כתמים גרעיניים, לחץ על זהה אובייקט ראשי, התאם את הסף לזיהוי גרעינים בודדים ולחץ על אמת אובייקטים ראשיים כדי להגדיר את הסף בהתבסס על אזורי אובייקטים ומיקום. לחץ על זהה כתמים עבור כל ערוץ המתאים לסמני השושלת הספציפיים והגדר את רוחב ערך הטבעת לשלושה ואת המרחק לאפס כדי לאפשר זיהוי של הפלואורסצנטיות הציטופלסמטית. בחר רמות התייחסות בזרימת העבודה כדי לבנות את הניתוח ולאפשר ספירה אוטומטית של הגרעינים המרוכזים בהתבסס על הגודל הגרעיני ועוצמת הכתמים הגרעיניים ועל התאים הספציפיים החיוביים לסמן בהתבסס על הפלואורסצנטיות הציטופלסמטית שזוהתה על ידי הטבעת, ולאחר מכן לחץ על הפעל.
במהלך השלב הראשון של התרבות, תאי הגזע העצביים שומרים על ביטוי הקינון שלהם. רוב התאים הם גם NG2-חיובי. תאים חיוביים CNPase המתאימים לשלב טרום oligodendrocyte ניתנים לזיהוי שלושה עד שישה ימים לאחר אינדוקציה בידול בתיווך T3, בעוד oligodendrocytes בוגר חיובי MBP מופיעים באחוז משמעותי לאחר שישה עד 12 ימים במבחנה.
ניתוח סינון בעל תוכן גבוה מאפשר זיהוי של תאים בודדים בתוך התרבות באמצעות כתמים גרעיניים וניתוח עוצמת פלואורסצנטיות. הרכב התרבות בסוף שלב הבידול שונה בהתאם לשאלה אם התרבויות הן ממוצא עוברי או מבוגר, עם תרבויות עובריות מגיבות יותר לבידול בתיווך T3, ומגיעות לאחוז גבוה יותר של אוליגודנדרוציטים בוגרים. שים לב כי כאשר תאי מבשר oligodendrocyte שמקורם בתאי גזע עצביים נזרעים בצפיפות גבוהה, הם מצטברים, ושכפול אסטרוציטים מייצרים במהירות שכבת תאים מתנשאת, ומונעים התבוננות בצורת רשת העכביש האופיינית של אוליגודנדרוציטים בוגרים.
דלקת בתיווך, בידול חסימה גורמת לירידה חזקה אוליגודנדרוציטים טרום ובוגר, כפי שזוהה על ידי CNPase ו MBP כתמים הן בתרבויות עובריות והן למבוגרים. עלייה במספר תאי מבשר אוליגודנדרוציטים מתרחשת גם בתרביות למבוגרים שטופלו בציטוקינים. בעוד שתאי המבשר של אוליגודנדרוציטים עובריים ומבוגרים מראים את אותו הדבר לחשיפה לציטוקינים דלקתיים, רק תרביות שמקורן בעובר רגישות לרעילות של מניעת גלוקוז בחמצן.
השיטה יכולה להיות מיושמת עם כל סוג של תאים מקדימים אוליגודנדרוציטים, בידול ותהליך הפרעה להבשלה, כדי לבחון אסטרטגיות חדשות שמטרתן להילחם במחלות המשפיעות על מיאלינציה או רמיאלינציה
